Der Fall
Die Injektionsreproduzierbarkeit bei kleinen Injektionsvolumina um die 1-2 µl (oder noch kleiner) stellt bei modernen Geräten heute zunächst keine besondere apparative Herausforderung dar. Falls dennoch in einem aktuellen Fall die Injektionsreproduzierbarkeit zu wünschen übriglässt: Wie sollte verfahren werden?
Die Lösung
Vorbemerkung:
Es versteht sich von selbst, dass für die nachfolgend beschriebene Tests reale Proben injiziert werden sollten; Injektionen von Standardlösungen zeitigen lediglich die Reproduzierbarkeit des Autosamplers für betreffendes Injektionsvolumen. Nicht jedoch, ob „hier und jetzt“ diese Methode an diesem Gerät gemäß den Anforderungen funktioniert. Injektionen von Standardlösungen sind nur dann statthaft, wenn im Rahmen der Validierung belegt worden ist, dass die Probematrix das Ergebnis nicht (signifikant) beeinflusst.
Als erstes würde ich das Injektionsvolumen wie in der Methode angegeben sowie das 2-, 3-, 4-fache davon injizieren. Wird die Peakfläche um das 2-, 3-, 4-fache erhöht? Wenn ja wissen Sie, dass in diesem niedrigen Konzentrationsbereich die Linearität gegeben ist. Als nächstes käme ein weiterer, etwas aufwendiger Test, die Notwendigkeit kann nur individuell bejaht werden: Jedes der vier Injektionsvolumina wird 5-mal injiziert und der Variationskoeffizient ermittelt. Der jeweils sich ergebende Variationskoeffizient zeigt Ihnen „schwarz auf weiß“, welche Präzision für welches Injektionsvolumen bei dieser Probe und diesen chromatographischen Bedingungen zu erwarten ist. Diese Kenntnis hilft zu beurteilen, ob die Anforderung an die Methode realitätsnah ist. Dieser Test soll keinesfalls die Prüfung auf Linearität ersetzen, vielmehr geht es hier darum zu überprüfen, ob die Signale (Peakflächen) der betreffenden Konzentrationen sich auf der Kalibriergeraden im unteren Bereich befinden. Etwas genauer: Ob die jeweiligen Mittelwerte aus den 5 Injektionen noch im Vertrauensbereich der Kalibriergeraden befinden, also oberhalb der Bestimmungsgrenze und somit im quantitativ „sicheren“ Bereich.
Nachfolgend werden einige Gründe genannt für den Fall, dass Test 1 und/oder Test 2 nach Ihren Kriterien nicht zufriedenstellend abgelaufen ist/sind:
- Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit ist zu groß für die Viskosität der Probelösung
- Durch Physisoption/Adhäsion an der Injektionsnadel geht ein Teil der Probe verloren. Merke in diesem Zusammenhang: Je verdünnter und je polarer die Probelösung ist und je geringer die Probekonzentration, umso größer ist generell die Gefahr für Sorption an allerlei „hungrigen“ Oberflächen
- Falls Einsätze („inserts“) in den Vials verwendet werden: Bei starker Verjüngung kann dort eine Luftblase entstehen, die bei repetitiven Injektionen zu mangelnder Reproduzierbarkeit führt. Das Aufkommen der Nadel auf den Boden des Vials/Inserts gehört grob in diese Kategorie von Fehlerquellen
- Wenn das Problem – also die Abweichung der Peakfläche vom erwarteten Wert oder die Streuung der Werte – mit der Zeit größer wird, handelt es sich um eine zeitabhängige Veränderung, nachfolgend drei Beispiele. Bemerkung: Ähnlich der Problematik bei der Physisoption: Es zeigt sich, dass die hier beschriebenen Schwierigkeiten bei stark verdünnten Proben und geringen Injektionsvolumina sich stärker bemerkbar machen im Vergleich zu Injektionen im ppm-Bereich und bei Injektionsvolumina größer ca. 5 µl
- Das Probelösungsmittel verdampft und somit ändert sich die Probenkonzentration im Vial
- Der pH-Wert der Probelösung ändert sich durch den Einfluss von Silanolgruppen an der Oberfläche vom Vial/insert, dadurch kann sich die UV-Absorption des Analyten ändern
- Die Konzentration von evtl. ausgewaschenen Metallionen aus der Injektionsnadel im Vial nimmt bei Wiederholinjektionen zu
Das Fazit
Test 1 hilft, schnell zu erfahren, ob überhaupt zuverlässige Ergebnisse bei der angegeben Konzentration erwartet werden können. Test 2 zeigt Ihnen anhand von Zahlenwerten, welches Injektionsvolumen der aktuellen Probe mit welcher Präzision injiziert werden kann.
