Welchen Einfluss haben der Integrationsalgorithmus und die Einstellparameter auf das Ergebnis?

Was ist der Unterschied zwischen Traditioneller und ApexTrack Integration?

Die Traditionelle Integration verwendet zur Bestimmung von Peak-Anfang und -Ende die Steigung des Messsignals. Diese Methode ist anfällig für eine falsche Integration, wenn die Basislinie selbst eine Steigung hat (Basislinien-Drift) oder die Peakform „schwierig“ ist (kein steiler Anstieg des Signals).

Die ApexTrack Integration verwendet hingegen die Steigung der zweiten Ableitung des Messsignals (die Krümmung des Messsignals). Die zweite Ableitung ist immer horizontal gerade, also frei von Drift.

Hier sind das Chromatogramm (schwarz) und die zweite Ableitung (blau) als Overlay dargestellt. Man kann deutlich erkennen, dass die zweite Ableitung frei von Drift ist. Dadurch wird eine sicherere Erkennung von Peak Anfang und Peak Ende erreicht.

Bedeuten gleich Integrationsparameter eine gleiche Integration?

Beide Integrationsalgorithmen verwenden die Parameter Peak Width und Threshold. Die Peak Width beschreibt dabei die Breite des schmalsten zu integrierenden Peaks, der Threshold ist ein Wert der für Rauschen der Basislinie und Form des Peaks steht. Daraus ergibt sich, die Integrationsparameter sind abhängig von Peak Größe und Form, sowie Drift und Rauschen.

Solange also alle Peaks einer Auswertung (eines Sample Sets) die gleiche Peak Größe und Form haben, solange erhält man mit gleichen Integrationsparametern die gleiche Integration. Ändert sich aber innerhalb einer Auswertung die Peak-Größe und -Form oder die Drift oder das Rauschen, so ändert sich auch das Ergebnis der Integration.

Welche Relevanz hat eine gleiche Integration?

Herstellerabhängig sind die HPLC-Anlagen unterschiedlich aufgebaut. Zu Beginn der HPLC gab es meist modulare Anlagen. Bei dieser Bauweise sind Pumpe, Injektor, Detektor als einzelne Geräte hintereinander angeordnet. Die einzelnen Module können auch von unterschiedlichen Herstellern stammen.

Im Pharmalabor ist typischerweise der erwartete Gehalt einer Probe bekannt. Soll also beispielsweise eine 80 mg Formulierung gemessen werden, so wird ein 80 mg Standard zur Kalibrierung verwendet. In diesem Fall ist also der zu integrierende Peak in Standard und Probe gleich groß und von gleicher Form. Hier könnten also die Parameter innerhalb einer Auswertung gleich sein.

In diesem Beispiel wurden Standards und Proben jeweils mit der gleichen Processing Methode und damit den gleichen Integrationsparametern ausgewertet. Die Parameter selbst wurden in den Methoden „Quantifizierung gut“ und „Quantifizierung schlecht“ aber unterschiedlich gesetzt. Obwohl die Flächen sich um 0,4% unterscheiden, beträgt der Unterschied im Amount nur 0,04%.

Anders verhält es sich bei Auswertungen, bei denen das Peakflächen-Verhältnis innerhalb eines Chromatogramms berechnet wird, ist die „richtige“ Integration wichtiger als das Festlegen fixer Integrationsparameter. Typisch ist dies bei Reinheitsbestimmungen, bei denen Unterschiede in Bezug Peak Form und Peak Anzahl zwischen den Chromatogrammen bestehen.

In diesem Beispiel wurden alle drei Chromatogramme mit denselben Parametern integriert. Allein die leichten Unterschiede in der Peak Form erzeugen eine vollkommen unterschiedliche Integration. Würde man hier das Flächenverhältnis der kleinen Peaks gegen den Hauptpeak berechnen, so würde man schwer vergleichbare Ergebnisse erhalten.

Eine Möglichkeit, eine bessere automatische Integration über ein Sample Set zu erhalten wäre, die Integrationsparameter an jedes Chromatogramm individuell anzupassen. Dies kann in Empower durch freilassen der Felder Peak Width und Threshold in der Processing Methode erreicht werden.

Jetzt bestimmt Empower die Parameter für Peakwidth und -threshold individuell für jedes Chromatogramm. Über dem jeweiligen Chromatogramm sind die verwendeten Integrationsparameter angegeben. Wie man sieht, variiert der Threshold Wert zwischen 1.100 und 1.300. Die erreichte Integration ist deutlich konsistenter, als die Integration mit einheitlichen Paramatern (vergleiche Abbildung 6). Es folgen nun einige weitere Beispiele über Traditionelle und ApexTrack Integration und über den Einfluss von Einstellparametern auf das Ergebnis. In Abbildung 8 wird ein Chromatogramm gezeigt, welches mit ApexTrack ausgewertet wurde. Es wurden 8 Peaks erkannt.

Das gleiche Chromatogramm wird in Abbildung 10 dargestellt, natürlich bei gleichen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, allerdings unter Traditional Integration ausgewertet. Es sind 13 Peaks erkannt worden.

Letzteres Chromatogramm wird abermals in Abbildung 11 wiedergegeben, einzige Veränderung: Statt einem Thresholdwert von 5 wurde 4 gewählt, es wird nur ein Peak integriert (die falsche Integration ist im hiesigen Zusammenhang von sekundärer Bedeutung, es geht um die Anzahl der registrierten Peaks im Report).

Ein letztes Beispiel soll demonstrieren, dass bei Standardeinstellungen aber unterschiedlichen Peakwidth- bzw. Threshold-Werten Chromatogramme bzgl. Integration wirklich nicht vergleichbar sind, siehe Abbildung 12.

Weitere Einstellparameter

Unter „TC=off“ erhält man die „ehrliche“ qualitative Information – er erfolgt keine Glättung, siehe Abbildung 13. Bereits eine Zeitkonstante von 0,3 s führt dazu, dass die Nebenkomponente an der vorderen Flanke „verschwindet“, Abbildung 14. Dazu generell folgende Bemerkung: Die hier besprochenen Parameter sind wichtig imfalle von früh eluierenden, kleinen Peaks. Bei großen, spät eluierenden Peaks (oft bei Gehaltsbestimmungen der Fall) spielen sie bei weitem eine untergeordnete Rolle.

Die nächsten zwei Beispiele sind zwar nicht Empower-spezifisch, dennoch möchten wir sie zeigen: Der Einfluss von Einstellparametern beim PDA auf die Integration ist nicht zu unterschätzen. Abbildung 15 zeigt ein Chromatogramm, das einmal bei einer Bandwidth von 12 nm und einmal bei 1,2 nm aufgenommen wurde. Der Aufsetzer an der Flanke des Hauptpeaks wird anders integriert, das macht ca. 8% aus. Die Fläche beim zweiten Peak ändert sich nur wenig. Ferner ist das Rauschen bei 1,2 nm stärker, das beeinflusst das Peak/Rausch-Verhältnis und damit die Nachweis- und die Bestimmungsgrenze.

In Abbildung 16 wird gezeigt, dass auch der Spalt die Integration beeinflussen kann.

Ein letztes Beispiel demonstriert, dass durch die Wahl eines Befehls um ein bestimmtes Ziel zu erreichen evtl. unbeabsichtigt auch andere „Sachen“ passieren können. In Abbildung 17 ist ein Chromatogramm bei identischen Einstellparametern, nur einmal ohne und einmal mit „Detect Shoulders“ (unteres Chromatogramm) zu sehen. Die Software berücksichtigt einen Schwellenwert, ab dem eine Störung als Schulter erkannt wird. Im unteren Chromatogramm wird der mittlere kleine Peak nun nicht integriert. Empower „meint“ nun, dies sei ein kleiner „Schulter“, also wird dieser nicht integriert!

Welche Integration ist richtig?

Jede, bei der die Basislinie den Peak richtig abschließt!

Die eine richtige Integration wird es nicht geben, sie wird immer vom „Auge“ des Auswertenden abhängen. Wichtig ist, dass eine Integration immer begründbar ist (also z. B., man folgt dem Basislinienverlauf des Blank).

Wie die Beispiele zeigen, ist bei einer Kalibrierung/Quantifizierung eine gleichartige Basislinie sowie identische Integrationsparameter entscheidend. Wichtig ist, dass man dann immer den gleichen „Fehler“ macht. Nimmt man dem Standard 10 % Fläche, der Probe aber auch, so bleibt das Verhältnis Standard/Probe das gleiche.

Anders verhält es sich bei Auswertungen, bei denen Peaks innerhalb eines Chromatogramms ins Verhältnis gesetzt werden. Hier ist der Vergleich mit der Integration eines anderen Chromatogramms unsinnig (der Vergleich der Ergebnisse natürlich nicht, also z. B. Berechnung des Mittelwertes der Ergebnisse zweier Injektionen).