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Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Der Fall

Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein?

Die Lösung

Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden:

1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät
2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“

Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt.

  1. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung
  • ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz
    (∆ Peakfläche, ∆ Peakform)
  • Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform)
  • Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare einer kurzen und dicken vorzuziehen; bei zweiter Variante ist das Dispersionsvolumen nämlich kleiner
  • Ist der Eluent bereits vorgemischt oder übernimmt das Gerät das Mischen?
    (∆ Retentionszeit)
  • Genaue Positionierung der Säule in einem Umluftofen (∆ Retentionszeit, evtl. ∆ Peakform)
  • In einem Labor werden die Proben angesetzt und man startet direkt die Sequenz. In einem anderen Labor werden viele Proben für mehrere Messplätze von einer Person angesetzt, anschließend werden sie verteilt. Im zweiten Fall befinden sich die Proben eine längere Zeit in den vials. Je nach Beschaffenheit der Glasoberfläche kann sich der pH-Wert einer wässrigen Probelösung nach einer Stunde im vial um mehr als eine pH-Wert-Einheit ändern. Oder aber im ersten Labor ist die Sequenz viel kürzer als im zweiten
    (∆ Retentionszeit, ∆ Peakform, evtl. ∆ Peakfläche)
  • Saphir- oder Keramikkolben? (Anfälligkeit gegenüber Salzen, Leckage möglich, dadurch ∆ Eluentenzusammensetzung und folglich ∆ Retentionszeit)
  1. Unterschiedliche Handhabung der Anlage

Die meisten modernen UHPLC/HPLC-Anlagen verfügen über nützliche Funktionen, die allerdings manchmal bewusst aktiviert werden müssen, nachfolgend einige Beispiele:

  • In einem Fall werden Luftblasen zur Vermeidung von Peakverbreiterung auf dem Weg der Probe vom Probengeber zur Säule erzeugt, im anderen Fall ist diese Funktion deaktiviert (∆ Peakform)
  • Ebenso: Kompressibilitätskorrektur „on“/“off“; automatische Korrektur oder muss jene manuell aktiviert werden? (∆ Peakform)
  • „Cooling“-Funktion (um zu verhindern, dass die Probe nach der Säule „warm“ am Detektor ankommt) aktiviert/nicht-aktiviert (∆ Peakform)
  • Läuft der Eluent permanent oder erfolgt während der Injektion eine Unterbrechung? Im zweiten Fall erfasst nach jeder Injektion eine Druckwelle die Säule (∆ Lebensdauer der Säule)
  • Wird die Ansaug- und Injektionsgeschwindigkeit automatisch der Viskosität der Probelösung angepasst? (∆ Präzision)

Das Fazit

Oft sind solche „Kleinigkeiten“ nur vor Ort zu entdecken. Oder aber man hat Glück und kommt bei einer „penibel-höfflichen“ Fragerei während eines Calls dahinter…

 

 

 

sk
31. März 2022
AllgemeinJahrestippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky und Chromy beim Denksport

Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung:

„Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“

  • „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern.

„Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen Peak liefert?“

  • „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“

Schlechte Packungsqualität und Totvolumen sind Substanz-unspezifische Problemquellen. Liegt eine solche vor, so ergibt sich stets – unabhängig von der Natur der injizierten Komponente – eine schlechte Peakform.

„Warum müssen die Substanzen in dieser Probe stark polar sein?“

  • „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“Wenn trotz geringer Konkurrenz um die Gunst der C18-Borsten seitens der Moleküle in der mobilen Phase (nur 10 % organischer Anteil) Substanzen an den hydrophoben C18-Borsten kaum haften können, müssen sie wohl sehr polar sein.

„Wieso tippst du auf eine Änderung der Flussrate?“

  • „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“Bei einer Änderung der Flussrate ändert sich im Falle eines konzentrationsempfindlichen Detektors, wie dem UV, nur die Peakfläche. Im Idealfall ändert sich die Peakhöhe überhaupt nicht, in der Praxis schon ein wenig.

„Wieso bist du sicher, dass sie eine isokratische Methode verwendet haben?“

  • „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate nicht – deswegen weiß ich es“Physikalische Parameter wie Säulenlänge, Fluss und Totvolumen beeinflussen im isokratischen Modus die Elutionsreihenfolge nicht. Im Gradientenmodus kann eine Änderung solcher mitunter zu einer Änderung der Elutionsreihenfolge führen. Merke: Bei einer Gradientenanlage spielt nicht das Totvolumen sondern das Verweilvolumen die entscheidende Rolle.

„Warum verwendest du für polare Komponenten im Eluenten Methanol statt Acetonitril?“

  • Weil Methanol in solchen Fällen häufig die bessere Selektivität aufweist“Die Erklärung steckt bereits in der Antwort: Für polare Komponenten ist die Selektivität in Methanol meist besser als in Acetonitril: Methanol unterbindet polare Wechselwirkungen nicht

„Warum vermeidest du für Routinemethoden nach Möglichkeit polare RP-Phasen?“

  • „Sie machen im Alltag generell mehr Probleme, auch deren Chargenreproduzierbarkeit lässt zu wünschen übrig“Auch hier steckt in der Antwort ein bekanntes Dilemma: Polare stationäre Phasen – ob lediglich welche mit polaren Gruppierungen oder auch Mixed Mode Phasen – sind zwar bzgl. Selektivität sehr interessant, bereiten jedoch häufiger Probleme als klassische C18-Phasen.

„Warum überprüft ihr bei jeder neuen Charge vials und Septen? Ist es nicht ein wenig übertrieben?“

  • Wir haben des Öfteren festgestellt, dass – neben der Injektionsnadel und der Purgeflüssigkeit – ihr Einfluss auf Peakform und Flächenreproduzierbarkeit enorm sein kann“Die Beschaffenheit der Glasoberfläche bei vials und die Art der Septen (dunkel- vs. hellrot, Silikoncharge etc.) können tatsächlich viel bewirken, bis hin zu (temporären) Geisterpeaks.
sk
28. Februar 2022
AllgemeinJahrestippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky & Chromy beim Denksport

Peaky ist wegen der doch sehr lange anhaltenden Pandemie und dem speziellen Jahresstart immer noch richtig „aufgekratzt“, er lässt den armen, gemütlichen Chromy – nach einem schnellen, obligatorischen „Ein gutes, neues Jahr 2022“ – einfach nicht in Ruhe. Chromy bleibt nichts anderes übrig als auf ihn einzugehen, er kann ja später mit den C18-Borsten weiter flirten.

Peaky: Du Chromy, wir wollen etwas spielen, OK? Und weil Du sooo gescheit bist, sollst Du Dich etwas anstrengen. Also: Ich präsentiere Dir Antworten und Du sollst Dir eine vernünftige, passende Frage überlegen. Und hör mal: Ich habe nicht so viel Zeit, die Silanole warten schon auf mich, also denk´ ratzfatz.

Er setzte sein schelmisches Lächeln auf und legte los:

  • „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“
  • „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“
  • „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“
  • „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“
  • „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate nicht – deswegen weiß ich es“
  • Weil Methanol in solchen Fällen häufig die bessere Selektivität aufweist“
  • „Sie machen im Alltag generell mehr Probleme, auch deren Chargenreproduzierbarkeit lässt zu wünschen übrig“
  • Wir haben des Öfteren festgestellt, dass – neben der Injektionsnadel und der Purgeflüssigkeit – ihr Einfluss auf Peakform und Flächenreproduzierbarkeit enorm sein kann“

Liebe Leserinnen, liebe Leser,

vielleicht haben Sie gerade mitten im Winter etwas Zeit und Lust sich passende Fragen zu überlegen. Falls ja, wünsche ich Ihnen viel Spaß dabei und viel Erfolg.

Senden Sie die passenden Fragen bis zum 25.02.2022 an info@kromidas.de. Die Gewinnerin/der Gewinner – bei mehreren richtigen Antworten entscheidet das Los – erhält das von mir gerade herausgegebene Buch „HPLC optimal einsetzen, Konzepte und Strategien für Methodenentwicklung und –optimierung“.

 

 

 

 

 

 

 

sk
3. Januar 2022