Startseite » HPLC Tipps des Jahres
AllgemeinJahrestipps

Wann ist eine „gute“ Peakform besonders wichtig?

Der Fall

Vereinfacht gesagt, ist die Trennleistung – Effizienz, „Performance“, als Bodenzahl wiedergegeben – ein Maß für die Peakform. Eine große Bodenzahl bedeutet scharfe, symmetrische Peaks, eine geringe Bodenzahl dagegen breite, evtl. tailende Peaks. Warum ist die Peakform bei der Trennung großer Moleküle, z. B. Biomoleküle, besonders wichtig oder kritisch?

Die Lösung

Zunächst gilt es drei Punkte festzuhalten:

  • In der Chromatographie ist die Auflösung (Resolution, R), also der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie, das wahrscheinlich aussagekräftigste Kriterium für die Güte einer Trennung
  • Die Auflösung ist abhängig von der Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Maß: Retentionsfaktor k), von der Selektivität (unterschiedlich starke Wechselwirkungen zweier Substanzen, Maß: Trennfaktor α) und von der Trennleistung (Peakform, Maß: Bodenzahl, N)
  • Ein wichtiger Trennmechanismus bei Biomolekülen (z. B. Proteine, monoklonale Antikörper) ist die Ausschlusschromatographie, SEC

In der SEC basiert die Trennung auf unterschiedliche Molekülgrößen, eine Wechselwirkung findet definitionsgemäß gar nicht statt (sollte …). Somit entfallen bzgl. Auflösung hier zwei der drei möglichen Optimierungsparameter, nämlich  Kapazität und Selektivität. Das bedeutet: Man kann in der SEC eine genügend gute Trennung nur über eine Verbesserung der Trennleistung, d.h. über die Peakform erzielen. Somit konzentrieren sich die Bemühungen bei der Optimierung einer SEC-Methode erstens auf die Unterbindung von Wechselwirkungen und zweitens auf eine Verbesserung der Peakform. Folglich kommen in der SEC bestimmten Optimierungsparametern eine gewichtigere Rolle als bei anderen Trennmechanismen zu:

  • Möglichst geringes Totvolumen der Apparatur, z. B. Innendurchmesser der Kapillaren < 0,13 mm, totvolumenfreie Verbindungen. Eine optimierte (!) UHPLC-Anlage ist hier von unermesslichem Vorteil – insbesondere bei der Verwendung moderner SEC-Säulen (eher kurz, eher dünn, eher kleine Teilchen), siehe Abbildung 1 und 2
  • Stark verdünnte Probelösungen
  • Möglichst kleine Flussraten
  • Optimale Einstellparameter, z. B. Zeitkonstante < 0,1 s, Spalt 16 nm
  • Lange Säulen, kleine Korngröße, Core Shell-Matrix
  • Physisorption/Adhäsion durch möglichst inerte Oberflächen verhindern, z. B Peak-lined Säulen, metallfreie Materialien im Fluidpfad, Vials mit inertisierter Oberfläche
  • Hohe Konzentration an Natriumperchlorat/Kaliumchlorid im Eluenten

Je ein Beispiel von Waters und Agilent sollen den Einfluss des Totvolumens auf die Auflösung in Fällen, wie den hier besprochenen, demonstrieren:

In Abbildung 1 führt der Wechsel einer 0,17 mm-Kapillare zu einer 0,07 mm-Kapillare dazu, dass ein Aufsetzerpeak immerhin sichtbar wird. Selbstverständlich sollte in diesem Zusammenhang an die erhöhte Gefahr von Niederschlag in sehr dünnen Kapillaren hingewiesen werden.

In Abbildung 2 wird die Verbesserung der Auflösung einer SEC-Methode aufgrund des kleinen Dispersionsvolumens in einer UPLC-Anlage (18 µl) dargestellt. Bemerkung: Für andere Trenntechniken wäre das Dispersionsvolumen (im Alltag kann man ruhig von „Totvolumen“ sprechen) von 30 µl der HPLC-Anlage vollkommen ausreichend.

sk
16. März 2023
A FehlersucheAllgemeinFlussInjektionsvolumenJahrestippsPeakverbreiterungpH-Wert des EluentenTotvolumen

Woher kommt das – weitere Symptome

Liebe Leser:innen,

zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.

Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.

In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.

 

Änderung (Symptom)Ursache(n)Welches Symptom noch?Kommentar
∆ A + ∆ H1. ∆ Injektionsvolumen

2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt)
3. ∆ Detektor

4. Instabile Probe

5. ∆ pH-Wert

6. ∆ Probekonzentration

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ∆ Peakform

1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit
2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen)
3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle
5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen
6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR,
A = konstant
1. Eluent
2. ∆ stationäre Phase
3. ∆ Temperatur
1. ∆ P

 

 

3. ∆ P

Stets:
t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel
auch
∆ Peakform

1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H,
A = konstant
∆ PackungsqualitättR = konstant,

Verschlechterung der Peakform

∆ tR, ∆ t0, ∆ A,
H = fast konstant
∆ Fluss∆ P Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform –
alle Peaks
 

1. Totvolumen
2. Verschlechterung der Packungsqualität

 

tR = konstant

Schlechte Peakform –
einige Peaks
∆ pH-WertBetroffene Peaks: ∆ tREtwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks1. Hohlraum im Packungsbeet
2. Verbogene Injektionsnadel
3. Substanz liegt in zwei Formen vor
 

 

3. pH-Wert minimal verändern

 

 

sk
4. Januar 2023