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HPLC Tipps des Jahres

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Trends in der HPLC

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Trends in der HPLC

Stavros Kromidas

Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt.
Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss.

Highlight: Mehrdimensionale Trennungen

Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken.

Begründung:
Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information in einem einzigen Lauf.
Vor diesem Hintergrund erweist sich HPLC-MS/MS oder auch UHPLC-HRMS erwartungsgemäß als völlig ungenügend. “Mehrdimensional“ bezieht sich an der Front der HPLC heute sowohl auf die chromatographische als auch – im Besonderen! – auf die Detektionsseite: In der ersten Dimension gesellt sich zu einer möglichst selektiven Säule immer mehr eine zweite orthogonale (z. B. RP-HILIC, LC-HPSEC) oder aber es wird eine zweite orthogonale Technik, z. B. eine enzymatische Reaktion, gewählt. Das Ziel ist, eine erste, maximal-mögliche Diskriminierung der Substanzen zu erreichen. Für die zweite Dimension eröffnet sich nach der zweiten (kurzen) Säule ein Potpourri an spektroskopischen Techniken. Diese werden miteinander kombiniert, um Ionen weiter zu fragmentieren und somit die Spezifität merklich zu erhöhen was letztendlich zu genauen Strukturinformationen führt. Techniken, die noch vor fünf Jahren auch unter MS-User als eher exotisch galten, geraten heute, ob ihres unbestrittenen Potentials immer stärker in den Focus, nachfolgend werden solche lediglich genannt: Ion mobility spectrometry (IMS), Differential Mobility Spectrometry (DMS), Collision Induced Dissociation (CID), Electron Activated Dissociation (EAD). Obschon eine Kombination beispielsweise von LC-HRMS/MS mit UV PD (Ultra Violet Photo Dissociation) zur Erfassung von organischen Mikro-Schadstoffen ihre Überlegenheit unter Beweis stellt, waren in der Mehrzahl zweifelsohne Vorträge mit der nunmehr fast „klassischen“ LC-ESI-IMS-MS/MS-Kopplung. Da es auch um Zeit geht, lautete ein bezeichnender Hinweis:
UHPLC = Sekunden
IMS = Millisekunden
MS = Mikrosekunden

Was war noch interessant?

  • IoT (Internet of Things) und Automation, eindeutig ja, Vernetzung von Geräten/Modulen noch eher rudimentär, KI-Einsatz äußerst zögerlich. Kann man in anderen Bereichen fast schon vom „Siegeszug“ der KI sprechen, lässt sich letztere bezüglich analytischen Labors reichlich Zeit … Eine weitere einfache, nicht uninteressante Frage lautete: Warum gibt es im Labor eigentlich kein flächendeckendes Bluetooth?
  • Das Thema „Unerwünschte Wechselwirkungen der Analyten mit Oberflächen“ wurde intensiv diskutiert. Es gibt bereits mehrere Säulen mit metallfreier Oberfläche, man arbeitet nun an HPLC-Anlagen an denen die Innen-Oberflächen keinerlei Schwermetallen/Schwermetallionen enthalten. Somit gäbe es keine Verschlechterung der Peakform von Komplex-fähigen Analyten und ebenso keine fehlerhaften Peakflächen
  • Grüne Chemie, hier insbesondere grüne HPLC wurde intensiv diskutiert; es wurde auf einen holistischen Ansatz hingewiesen: Herstellungskosten, Transportkosten, Betriebskosten inkl. Chemikalien und Energie, Zeit zur Datenerhebung, Sinnhaftigkeit der ermittelten Daten, Verarbeitung, Deutung und Verwertung der Informationen, Entsorgung von Chemikalien und Hardware. Aber es wurde auch konkret beispielsweise über Alternativen zu Acetonitril und Methanol gesprochen: Propylencarbonat bzw. Ethanol
  • Immer mehr Teile werden per 3 D-Druck hergestellt, so z. B. ein kompletter Detektor für unter 2.000,00 €. Die Verfechter dieser Entwicklung, die natürlich nicht aus dem Herstellerumfeld kommen, plädieren für eine Umwelt-freundliche, individuelle und auch gerechtere Analytik: Labore auch in ärmeren Ländern könnten individuelle, maßgeschneiderte, Umwelt-freundliche Lösungen für die Analytik kreieren, so unter anderem einfache, robuste, portable HPLC-Geräte
  • Ein zeitloses Thema, das seit Jahrzenten in keiner Tagung fehlt, ist nach wie vor „Fundamentals“. Micro- und Nano-LC sowie CE stellen eher kleinere, interessante Segmente dar, ein echter Durchbruch ist im Moment nicht in Sicht
  • Nachdem in den letzten Tagungen die 2 D-Chromatographie beschrieben und ihre Vorteile einem breiten Publikum bekannt gemacht worden sind, ging es in Düsseldorf um Optimierungsstrategien, um Vorschläge zur effizienten SPAM (Stationary Phase Assisted Modulation), um Details und Tricks aus der Praxis. Ein einziges Beispiel soll das Potential der 2 D-Chromatographie demonstrieren: 160 automatisierte Läufe, Peakkapazität 4.800, 1 Peak/sec
  • SFC und insbesondere HILIC spielen sowohl bzgl. Zahl der Anwendungsfelder als auch Modellierung von Mechanismen die Rolle, die die RP-HPLC in den 1970er und 1980er Jahre innehatte
  • Durch die weiter oben erwähnten Möglichkeiten der Spektroskopie erfahren Gebiete wie Umwelt- und Pharmaanalytik, Biologie, Medizin und natürlich Biochromatographie einen enormen Schub. Bei Letzteren stand in vorderer Stelle die Analytik von Glykanen und Oligonukleotiden, Proteine sind und bleiben natürlich ein Dauerthema

Die nächste Veranstaltung in Europa findet im Juni 2025 in Brügge statt.

sk
5. Juli 2023
A FehlersucheChromatogrammGeisterpeaks & negative PeaksInjektionsvolumenJahrestippspH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)Veränderung des Chromatogramms

Wenn die Probleme aus dem vial kommen …

Der Fall

Sie konnten für bestimmte Probleme (Geisterpeaks, Tailing etc.) das/die vial(s) inkl. Inhaltes als Ursache identifizieren. Und dies obwohl an der Methode eigentlich „nichts“ geändert wurde. An was sollten Sie – auch – denken?

Die Lösung

Probleme können zunächst durch die Injektion selbst hervorgerufen sein. So kann beispielsweise die Injektionsnadel durch ein Septumpartikelchen oder Salzkriställchen teilweise verstopft sein; oder die Nadelspitze ist aufgrund eines harten (dunkelroten) Septums minimal verbogen; oder sind die Purgeflüssigkeit und/oder die Lösung im Waschvial schlicht alt; oder schließlich verhindert Luft in der Spritze/Injektionsnadel das Ansaugen des eingestellten Injektionsvolumens. Hier wollen wir uns jedoch nur auf das/die vial(s) bzw. sein Inhalt als Fehlerquelle konzentrieren. Nachfolgend sind einige Ursachen aufgeführt, die zu einem veränderten Chromatogramm führen können: Veränderung der Peakfläche bzw. Peakform, zusätzliche Peaks, Retentionszeitverschiebungen etc.

  1. Beispiele für Veränderungen der Probelösung
  • Der pH-Wert Ihrer wässrigen Probelösung hat sich durch Silanolgruppen an der Oberfläche des vials geändert, diese Änderung kann innerhalb einer Stunde über eine pH-Wert-Einheit ausmachen. Es kann sein, dass bei einer langen Sequenz sich eine größere – da zeitabhängige – pH-Wert-Veränderung bei den letzten vials stärker bemerkbar macht; oder Sie haben eine neue Charge von vials eingesetzt deren Oberfläche acidere Silanolgruppen aufweist; oder die Probe bleibt eine längere Zeit im vial, da der Probengeber aufgrund einer kleinen Reparatur eine Stunde lang nicht im Betrieb war
  • Die Probe bzw. die Matrix ist vielleicht doch ein wenig „anders“ als bei der letzten Messung, z. B. die Produktion/Galenik hat das Herstellungsverfahren/die Formulierung minimal geändert und diese „unwichtige“ Info wird dem Labor nicht übermittelt. Analog auch eine kleine Veränderung des Packmittels: Neue Bestandteile darin diffundieren in die zu analysierende Probe. Eine biologische oder Umweltprobe weist natürliche Schwankungen auf, z. B. war der Sommer eher trocken oder eher nass (Milch, Pflanzensaft, Tabak), erfolgt die Blutentnahme wirklich zur gleichen Uhrzeit, sind die Transportbedingungen konstant geblieben? Eine evtl. veränderte Matrix kann nicht nur zu zusätzlichen Peaks führen, sondern durch eine Änderung des pH-Wertes auch zu Retentionszeitverschiebungen, Änderung der Peakform, im schlimmsten Fall auch zu einer Veränderung der Peakfläche. Beispiel: Eine hochdosierte Tablette hat eine andere Konzentration an Magnesiumkarbonat als die zuletzt gemessenen Proben, was zu einer Veränderung des pH-Wertes der Wirkstofflösung führt; die nun ionisiert vorliegende Form des Wirkstoffs hat eine andere UV-Absorption. Der pH-Wert der Standard-/Systemeignungslösung bleibt dagegen konstant
  1. Veränderungen, die von „außen“ kommen
  • Das Material der neu eingebauten Injektionsnadel ist ein wenig oder gänzlich „anders“; evtl. werden jetzt mehr/andere Metallionen herausgewaschen, die mit Bestandteilen der Probe beispielsweise Komplexe bilden. Bemerkung am Rande: Nicht nur Eisen- sondern auch Titanionen sind zur Komplexierung fähig …
  • Die Proben waren womöglich längere Zeit als sonst dem Sonnenlicht ausgesetzt oder es wird neulich in unmittelbarer Nähe des Autosamplers mit starkflüchtigen Aromastoffen gearbeitet
  • Bei der Person, die die vials vorbereitet, gab es eine – wie auch immer geartete – Veränderung, die direkt oder indirekt mit dem Handling zu tun hat, z. B: Neues Parfum oder die Hände werden nun eingecremt oder es erfolgt seit einigen Wochen eine Hormontherapie (Diffusion von Aminosäuren aus der Haut). Oder aber man hat Ihnen gesagt, dass das Schütteln eines vials generell von Vorteil sei, und Sie nahmen diese Empfehlung seit kurzem an
  • Neue/andere Septen bzgl. Farbe, Material, Aufbau – ihr Einfluss sollte ernst genommen werden!
  • Die Proben werden vielleicht im Ultraschallbad aufgelöst. Und dort gab es eine Veränderung, die wahrlich viel bedeuten kann: Neues U-Bad, z. B. rund statt eckig, statt 30 kHz jetzt 50 kHz, statt Leitungswasser jetzt destilliertes Wasser, die Wasserhöhe ist eine andere, es ist eine Gummimatte unter das U-Bad gelegt worden, die Probelösungen befinden sich jetzt in einem (größeren) Becherglas statt in einem Drahtgestell, oder aber: Es wird zwar weiterhin ein Drahtgestell verwendet, jedoch mit größeren Maschen, usw.

Das Fazit

Neue Charge von vials/Septen, kleinere Veränderungen im Handling, geänderte Matrix oder Änderungen am Probengeber bzw. an der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Anlage sind mögliche Ursachen für Veränderungen des Inhalts des vials und folglich für veränderte Chromatogramme bei sonst gleichen chromatographischen Bedingungen.

 

 

sk
5. April 2023
AllgemeinJahrestipps

Wann ist eine „gute“ Peakform besonders wichtig?

Der Fall

Vereinfacht gesagt, ist die Trennleistung – Effizienz, „Performance“, als Bodenzahl wiedergegeben – ein Maß für die Peakform. Eine große Bodenzahl bedeutet scharfe, symmetrische Peaks, eine geringe Bodenzahl dagegen breite, evtl. tailende Peaks. Warum ist die Peakform bei der Trennung großer Moleküle, z. B. Biomoleküle, besonders wichtig oder kritisch?

Die Lösung

Zunächst gilt es drei Punkte festzuhalten:

  • In der Chromatographie ist die Auflösung (Resolution, R), also der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie, das wahrscheinlich aussagekräftigste Kriterium für die Güte einer Trennung
  • Die Auflösung ist abhängig von der Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Maß: Retentionsfaktor k), von der Selektivität (unterschiedlich starke Wechselwirkungen zweier Substanzen, Maß: Trennfaktor α) und von der Trennleistung (Peakform, Maß: Bodenzahl, N)
  • Ein wichtiger Trennmechanismus bei Biomolekülen (z. B. Proteine, monoklonale Antikörper) ist die Ausschlusschromatographie, SEC

In der SEC basiert die Trennung auf unterschiedliche Molekülgrößen, eine Wechselwirkung findet definitionsgemäß gar nicht statt (sollte …). Somit entfallen bzgl. Auflösung hier zwei der drei möglichen Optimierungsparameter, nämlich  Kapazität und Selektivität. Das bedeutet: Man kann in der SEC eine genügend gute Trennung nur über eine Verbesserung der Trennleistung, d.h. über die Peakform erzielen. Somit konzentrieren sich die Bemühungen bei der Optimierung einer SEC-Methode erstens auf die Unterbindung von Wechselwirkungen und zweitens auf eine Verbesserung der Peakform. Folglich kommen in der SEC bestimmten Optimierungsparametern eine gewichtigere Rolle als bei anderen Trennmechanismen zu:

  • Möglichst geringes Totvolumen der Apparatur, z. B. Innendurchmesser der Kapillaren < 0,13 mm, totvolumenfreie Verbindungen. Eine optimierte (!) UHPLC-Anlage ist hier von unermesslichem Vorteil – insbesondere bei der Verwendung moderner SEC-Säulen (eher kurz, eher dünn, eher kleine Teilchen), siehe Abbildung 1 und 2
  • Stark verdünnte Probelösungen
  • Möglichst kleine Flussraten
  • Optimale Einstellparameter, z. B. Zeitkonstante < 0,1 s, Spalt 16 nm
  • Lange Säulen, kleine Korngröße, Core Shell-Matrix
  • Physisorption/Adhäsion durch möglichst inerte Oberflächen verhindern, z. B Peak-lined Säulen, metallfreie Materialien im Fluidpfad, Vials mit inertisierter Oberfläche
  • Hohe Konzentration an Natriumperchlorat/Kaliumchlorid im Eluenten

Je ein Beispiel von Waters und Agilent sollen den Einfluss des Totvolumens auf die Auflösung in Fällen, wie den hier besprochenen, demonstrieren:

In Abbildung 1 führt der Wechsel einer 0,17 mm-Kapillare zu einer 0,07 mm-Kapillare dazu, dass ein Aufsetzerpeak immerhin sichtbar wird. Selbstverständlich sollte in diesem Zusammenhang an die erhöhte Gefahr von Niederschlag in sehr dünnen Kapillaren hingewiesen werden.

In Abbildung 2 wird die Verbesserung der Auflösung einer SEC-Methode aufgrund des kleinen Dispersionsvolumens in einer UPLC-Anlage (18 µl) dargestellt. Bemerkung: Für andere Trenntechniken wäre das Dispersionsvolumen (im Alltag kann man ruhig von „Totvolumen“ sprechen) von 30 µl der HPLC-Anlage vollkommen ausreichend.

sk
16. März 2023
A FehlersucheAllgemeinFlussInjektionsvolumenJahrestippsPeakverbreiterungpH-Wert des EluentenTotvolumen

Woher kommt das – weitere Symptome

Liebe Leser:innen,

zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.

Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.

In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.

 

Änderung (Symptom)Ursache(n)Welches Symptom noch?Kommentar
∆ A + ∆ H1. ∆ Injektionsvolumen

2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt)
3. ∆ Detektor

4. Instabile Probe

5. ∆ pH-Wert

6. ∆ Probekonzentration

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ∆ Peakform

1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit
2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen)
3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle
5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen
6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR,
A = konstant		1. Eluent
2. ∆ stationäre Phase
3. ∆ Temperatur		1. ∆ P

 

 

3. ∆ P

Stets:
t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch
∆ Peakform

1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H,
A = konstant		∆ PackungsqualitättR = konstant,

Verschlechterung der Peakform

∆ tR, ∆ t0, ∆ A,
H = fast konstant		∆ Fluss∆ P Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform –
alle Peaks		 

1. Totvolumen
2. Verschlechterung der Packungsqualität

 

tR = konstant

Schlechte Peakform –
einige Peaks		∆ pH-WertBetroffene Peaks: ∆ tREtwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks1. Hohlraum im Packungsbeet
2. Verbogene Injektionsnadel
3. Substanz liegt in zwei Formen vor		 

 

3. pH-Wert minimal verändern

 

 

sk
4. Januar 2023