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Apparatur

Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, Jahrestipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz (∆ Peakfläche, ∆ Peakform) Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform) Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare…

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Unruhige Basislinie – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Allgemein, Apparatur, Detektor, Dichtungen

Der Fall Starkes Rauschen der Basislinie hat hauptsächlich zwei Ursachen: Entweder sind es Flussschwankungen oder es handelt sich um elektronisches bzw. optisches Rauschen. Wie kann man die zwei Ursachen unterscheiden? Die Lösung In Abbildung 1 und 2 sind typische Beispiele von diversen „unschönen“ Basislinien. Es handelt sich dabei um eigene Messungen und um Beispiele von Günther Eppert, die mit Genehmigung gezeigt werden. Faustregel: Periodisches, mehr oder weniger regelmäßiges Rauschen deutet auf Probleme mit der Pumpe hin, das wäre „Mechanik“. Hochfrequentes, „unruhiges“ Rauschen deutet auf Elektronik bzw. Optik hin. Abbildung 1 Pumpe Abb. 1 Oberes und mittleres Bild: Flussschwankungen aufgrund von Luft in der Pumpe Unteres Bild: Defekte Kolbendichtung Abbildung 2 Detektor Abb. 2 Oberes Bild: Minimale Druckschwankungen im Bereich von ca. 0,1 bar wie hier führen zur Bildung von Schlieren, die vom UV-Detektor registriert werden und zu einem hochfrequenten Rauschen führen Mittleres Bild: Belag auf dem Fenster eines UV-Detektors Unteres Bild: Defekte Deuteriumlampe Das Fazit Beim periodischen, gleichmäßigen Rauschen ungefähr gleichbleibender Amplitude denke an die Pumpe: Dichtung, Leck, Luft. Beim hochfrequenten, unruhigen Rauschen denke an Elektronik bzw. Optik: Schwache Lampe, Haarriss am Detektor, Belag in der Zelle, verschmutztes MS-Interface, Spülautomat (oder sonstiges …) in unmittelbarer Nähe zu einer HPLC-Anlage mit…

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Vials als Quelle für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Probengeber

Vials – Glas-/Polymerkörper, Septen, Kappen – können eine Quelle für Geisterpeaks sein; nachfolgend skizziere ich einige Ursachen sowie mögliche Tests zum Erfassen und ggf. Lokalisierung des Problems. Mehrfache Injektion aus einem vial; erste Injektion OK, zweite und dritte, Geisterpeaks, vierte OK. Man kann schier verzweifeln…Eine mögliche Erklärung: Bei der ersten Injektion durchsticht die Nadel das erste Mal das frische Septum, es wird injiziert, alles bestens. Nach der Injektion erfolgt üblicherweise ein Purgen der Nadel. Bei der anschließenden zweiten Injektion befindet sich durch das Purgen womöglich Restlösungsmittel an der Außen-Oberfläche der Nadel. Jenes Lösungsmittel kann nun an der jetzt frei gewordenen Septum-Oberfläche an der Stichstelle Hilfsstoffe aus dem Septum herauslösen, die als kleine Zusatzpeaks erscheinen. Dies passiert vielleicht nur 1-2 Mal, denn: Die Konzentration dieser Hilfsstoffe ist gering, nach der vierten oder fünften Injektion sind sie „weg“, ab jetzt sind keine Geisterpeaks mehr zu sehen Die Probe befindet sich im Kühlschrank. Um einen Temperatur- und somit einen Konzentrationsgradienten im vial zu verhindern wird jenes gründlich durchgeschüttelt. Je nach Lösungsmittel in der Probelösung können Hilfsstoffe aus der Unterfläche des Septums herausgelöst werden – es erscheinen Geisterpeaks Teflon auf Gummi bei neuen Septen: Geisterpeaks Folgendes Problem dürfte nur bei älteren Materialien auftauchen, dennoch…

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Ist ein zusätzliches Entgasen notwendig?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Im HPLC-Umfeld wird immer wieder die Frage diskutiert, ob denn für das Entgasen der mobilen Phase der eingebaute Degasser ausreicht. Ist in etwa ein zusätzliches Entgasen im Ultraschallbad sinnvoll/notwendig? Die Lösung Ich habe mich mit dieser Frage beschäftigt und dazu einige Experimente  durchgeführt. Nachfolgend in verdichteter Form die Ergebnisse: Ein technisch ordnungsgemäß funktionierender Degasser reicht in der Regel vollkommen aus – vorausgesetzt, die Schläuche bzw. Membrane sind neu, denn: Mit der Zeit entstehen Mikrorisse, jene führen dazu, dass erstens kein gutes Vakuum erzeugt werden kann und dass zweitens Bestandteile der mobilen Phase an der dort größer gewordenen Oberfläche adsorbiert werden können, Ergebnis: Memory Effekt und folglich Geisterpeaks. Schlussfolgerung: Man sollte die Membrane als ein Verschleißteil ansehen und abhängig vom Betrieb der HPLC-Anlage diese alle 3-4 Jahre austauschen Für den Fall von sehr anspruchsvollen Messungen, z. B: Spurenanalytik mit vielen Peaks bei sehr niedrigen Wellenlängen, gilt: Ein zusätzliches Behandeln des Eluenten im Ultraschallbad bzw. das Entgasen mit Helium bringt eine (kleine) Verbesserung, siehe Abbildung 1. Die UV-Absorption bei ca. 1,8 min wurde gegenüber dem Entgasen lediglich mit dem Degasser von ca. 0,0005 AU auf ca. 0,0001-0,0003 AU herabgesetzt.   Abb. 1 entgasen der mobilen Phase in der HPLC; Vergleich…

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Regulierter Bereich, feststehende Prüfvorschrift, geforderte Auflösung wird nicht erreicht – was ist möglich?

Von Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,…

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Die „Kleinen“ im Sommer… Optimale Zeitpunkt für die Elution der wichtigsten/kritischen Peaks, Lagerung in MeOH/ACN, isokratische Stufe beim Gradienten im Fall von kurzen Säulen

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps Demo, Lebensdauer der Säule, Säule, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized, Verweilvolumen

 

  • Optimale Zeitpunkt für die Elution der wichtigsten/kritischen Peaks
  • Lagerung in MeOH/ACN
  • Isokratische Stufe beim Gradienten im Fall von kurzen Säulen

 „Optimale“ Elution – wann sollen meine wichtigsten Peaks eluieren?

Zunächst direkt die Aussage: Die optimale Elution für die interessierenden Peaks liegt nach ca. der drei bis fünffachen Totzeit („Front“, Injektionspeak). Sehen Sie zu, dass – wenn irgendwie möglich – wichtige/kritische Peaks bei einem Retentionsfaktor, k (k: Maß für die Stärke der Wechselwirkungen), von etwa drei bis fünf eluieren, d.h. eben nach der drei bis fünffachen Totzeit. Warum? Hier drei Gründe:
1. Ab hier etwa fängt der robuste Bereich an. Die Konsequenz: Konstante Retentionszeiten in der Routine; kleine ungewollte Veränderungen beim Eluenten oder bei der Temperatur wirken sich kaum aus
2. Dieser Bereich entspricht einem optimalen Bereich der Wechselwirkungen. Die Konsequenz: Optimaler Beitrag von k sorgt für eine gute Auflösung
3. In diesem Bereich ergibt sich eine gute Effizienz (gute Bodenzahl). Die Konsequenz: Keine übermäßige und damit störende Peakverbreiterung

In Methanol/Wasser gelagerte Säulen 

Für längere Zeiträume (mehrere Wochen/Monate) eignen sich zur Lagerung von polaren RP-Phasen eher ACN/H2O- (mehr als ca. 60 % ACN) als MeOH/H2O-Gemische. Begründung: In einem ACN/H2O-Gemisch ist die Gefahr der Abspaltung durch Hydrolyse von kleinen, polaren funktionellen Gruppen, z. B. C8, C4, Diol, CN, PFP, Phenyl-Hexyl usw. – also das bekannte „Bluten“ der Säule – nahezu unerheblich. 100% Methanol dürfte dagegen unkritisch sein. Soweit, so gut. Nun, einige Hersteller liefern ihre Säulen in MeOH/H2O. Was kann jetzt passieren? Sie arbeiten mit einer recht polaren RP-Säule und die Trennung funktioniert bestens. Sie bestellen beim gleichen Hersteller erneut die gleiche Säule, mit dem Herstellerhinweis, dass es sich um die gleiche Charge wie bei der ersten Säule handelt, dennoch sieht Ihr Chromatogramm „scheußlich“ aus. Es mag sein, dass es sich um die gleiche Säulen-Charge handelt. Die zweite jedoch war beim Hersteller eventuell längere Zeit gelagert. Ein Teil der polaren funktionellen Gruppen, siehe weiter oben, ist womöglich abgespalten und man erhält im Fall von basischen Komponenten beispielsweise stark tailende Peaks, denn: Jene interagieren nun mit frei gewordenen aktiven Silanolgruppen.

„Gleiche“ Charge ist nicht für jeden dasselbe…

Es ist zweifelsohne sinnvoll, im Rahmen der Methodenentwicklung oder später bei der Validierung drei Säulenchargen auszutesten. Hier ist Vorsicht geboten: Wenn Sie beim Hersteller drei Säulen aus drei „verschiedenen Chargen“ bestellen, bekommen Sie meist tatsächlich drei Säulen aus drei unterschiedlichen Herstellungsschargen. Für manchen Hersteller jedoch bedeutet „unterschiedliche Chargen“, dass die Säulen zu unterschiedlichen Zeitpunkten gepackt worden sind, sie sind jedoch aus der gleichen Herstellungscharge…

Denke an MeOH bzw. MeOH/ACN-Gemische

Wasser aus dem Eluenten wird an der Oberfläche von polaren, stationären Phasen adsorbiert. Bei der Trennung von polaren Komponenten wirkt sich dies positiv aus. Als organisches Lösungsmittel eignet sich bei Trennungen von polaren Komponenten tendenziell eher Methanol als Acetonitril. Erwarten Sie nicht ausschließlich stark polare Komponenten sondern auch moderat-polare und evtl. auch neutrale (apolare) Komponenten? Für diesen Fall folgender Vorschlag: Wenn Sie Ihren Gradienten beispielsweise mit 20% B starten und auf 80% B hochfahren möchten, könnten Sie mit 10% MeOH/10% ACN starten und dann auf 40% MeOH/40% ACN hochfahren: Sie nutzen in diesem Fall die gute polare Selektivität durch das Methanol und die gute Peakform durch das ACN (geringe Viskosiität, scharfe Peaks). Generell gilt: Eine ternäre Mischung, also Wasser bzw. Puffer-ACN-MeOH, erweist sich bei einer großen Polaritäts-Bandbreite der Komponenten in der Probe oft als vorteilhaft. Dies gilt auch und gerade bei isokratischen Trennungen.

Großes Verweilvolumen und kleines Säulenvolumen…

Ein großes Verweilvolumen („Dwell“- oder „Delay-Volume“) bei einer Gradientenanlage bedeutet, dass zu Beginn des Gradienten eine isokratische Stufe vorgeschaltet ist. Eine solche mag mitunter etwas Positives bewirken: Manche Peaks am Chromatogramm-Anfang werden besser abgetrennt, als wenn der Gradient „sofort“ an der Säule wäre und dort direkt wirkte. Bei einer kurzen Säule jedoch „sieht“ der Gradient im Fall eines längeren isokratischen Schrittes am Anfang nur einen Teil der Säule, d.h. es werden im schlimmsten Fall nur 50% der Säulenlänge ausgenutzt. Die Peaks werden nach hinten „gestaucht“, bei mehr als 10-15 Peaks werden die letzten Peaks evtl. schlecht abgetrennt.

Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Von Apparatur, B Optimierung, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die…

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Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)…

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HPLC im Frühjahr… 

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Auto-Sampler, Detektor, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche…

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Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Von Apparatur, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun…

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