0
Startseite » HPLC-Tipps-Datenbank » HPLC-Tipps Übersicht
ApparaturB OptimierungChromatogrammGradientMonatstippOptimierungPeakverbreiterungTotvolumen

Der Gradient in der HPLC (2)

Säulendimensionen und Totvolumen: Wie beeinflussen sie die Trennung im Gradienten-Modus im Vergleich zu isokratischen Trennungen?

Zusammenfassung:
Isokratische Methoden:
Bei großen Säulenvolumina spielt das Totvolumen eine untergeordnete Rolle, bei kleinen Säulenvolumina (kurze/dünne Säulen) sehr wohl, vereinfacht gesagt: Eine lange/dicke Säule „verzeiht“ eine schlechte Apparatur, eine kurz/dünne tut es nicht.
Gradienten-Methoden:
Das Totvolumen spielt hier kaum eine erwähnenswerte Rolle.

Erläuterungen und Beispiele:

In Abbildung 1 wird eine isokratische Trennung an zwei Hypersil GOLD-Säulen gezeigt; links eine 125 x 4 mm-Säule, rechts eine 50 x 2,1 mm-Säule.

Abbildung 1
Isokratische Trennung an einer großen (links) und an einer kleinen (rechts) Säule, Details, siehe Text

Die Auflösung der fünf Peaks an der kleineren Säule (rechts) ist schlechter, die Peaks sind recht breit. Wir brauchen keine Formeln, um das zu erklären, ein einfacher Zahlenvergleich reicht aus:

– Die große Säule hat ein Säulenvolumen von ca. 1.250 µl, die kleine von ca.139 µl
– Das Totvolumen der Apparatur (Volumen vom Autosampler bis einschließlich
Detektor ohne Säule) betrug hier ca. 80 µl

Das Totvolumen entspricht somit nur ca. 6,4 % dem Säulenvolumen der großen Säule.
Bei der kleinen Säule sind es ca. 58,0 % – und das ist nicht grade wenig …
Halten wir fest: Je kleiner das Säulenvolumen ist, umso kritischer wird bei isokratischen Trennungen das Totvolumen der Apparatur.

In Abbildung 2 ist ein Gradientenlauf mit der kleinen Säule an der gleichen Apparatur zu sehen: Wir erhalten eine fantastische Peakform – trotz des weiterhin vorhandenen recht großen Totvolumens.
Im Gradientenmodus spielt das Totvolumen der Apparatur kaum eine Rolle:
Die während eines Gradientenlaufs immer stärker werdende Elutionskraft (immer mehr % B) sorgt dafür, dass die Moleküle an der hinteren Flanke des Peaks stärker „nach vorne“ geschoben werden als die Moleküle an der vorderen Flanke. Dies wirkt gegen die in Flussrichtung stets zunehmende Bandenverbreiterung aus, Ergebnis: Die zwei Effekte heben sich gegenseitig in etwa auf, die Peaks bleiben beim Gradienten schmal. Das ist auch der Grund, warum beim Gradienten die Peakbreite aller Peaks im Idealfall gleich ist.

 

Abbildung 2
Gradiententrennung mit einer kleinen Säule an einer „schlechten“ Apparatur, Details, siehe Text

Ein zweites, schönes Beispiel von Monika Dittmann, Agilent, dient, um das bereits Vorgestellte noch einmal zu veranschaulichen: In Abbildung 3 oben (A) wird eine isokratische Trennung mit einer 1-mm-Säule gezeigt, hier liegt also ein recht kleines Säulenvolumen vor. Durch eine bewusst falsch angeschlossene Kapillare entstand ein merkliches Totvolumen, die Peaks zeigen ein starkes Tailing. Ohne an der Apparatur etwas zu ändern, wurde mit der gleichen Säule ein Gradient gefahren, Abbildung 3, Mitte (B). Ergebnis: Hervorragende Peakform. Durch eine korrekte Kapillarverbindung und dadurch Eliminierung des Totvolumens ergab sich nun anschließend auch im isokratischen Modus eine sehr gute Peakform, Abbildung 3, unten (C).

 

Abildung 3
Isokratische und Gradienten-Trennungen mit einer 1 mm-Säule mit und ohne merklichem Totvolumen der Apparatur, Details, siehe Text

Eine Bemerkung, bevor wir zum Fazit kommen:
Ich spreche hier vom „Totvolumen“, weil dieser Begriff geläufig ist und als erste Näherung den Sachverhalt genügend gut beschreibt. Genauer müsste man/frau vom Dispersionsvolumen sprechen: Eine lange Kapillare mit einem kleinen Durchmesser mag das gleiche (Tot)Volumen aufweisen wie eine kürzere mit einem größeren Durchmesser. Das Dispersionsvolumen aber, das vom Durchmesser in der 4. Potenz abhängt, ist im ersten Fall viel kleiner. Und da die Peakverbreiterung vom Dispersionsvolumen beeinflusst wird, wäre die Peakform im ersten Fall wesentlich besser.
Schlussfolgerung:
Nehmen Sie lieber eine lange, dünne Kapillare statt einer kurzen, dicken.

Fazit:
Wenn Sie an einer Apparatur ausschließlich im Gradienten-Modus arbeiten, entsteht für „normale“ Fragestellungen kaum Handlungsbedarf bzgl. Hardwareoptimierung – alle Gradienten-Anlagen sind gut genug. Arbeiten Sie an besagter Apparatur auch isokratisch, müssten Sie bei Verwendung von kurzen/dünnen Säulen und kleinen Teilchen evtl. tätig werden, z. B. an dünnere Kapillaren, kleineres Zellvolumen, totvolumenfreie Verbindungen und/oder besseres Design der Detektor-Zelle denken. Sonst verlieren Sie unter Umständen an Trennleistung.

sk
2. April 2026
A FehlersucheACNApparaturAuflösungGeisterpeaks & negative PeaksGradientJahrestippsMethodentransferVerweilvolumen

Der Gradient in der HPLC (1)

Heute: Wie beeinflusst die Mischkammer meine Trennung?

Der Gradient in der HPLC hat wahrlich eine Menge interessanter Aspekte …
Ich greife für die nächsten sechs HPLC-Tipps einen einzigen Aspekt heraus: Was genau können physikalische Parameter beim Gradienten bewirken? Und: Was ist dabei anders im Vergleich zu isokratischen Trennungen? Unter „physikalische“ Parameter sind folgende gemeint, die wir uns heute und in den nächsten HPLC-Tipps näher anschauen werden:

  • Mischkammer
  • Totvolumen bzw. Verweil- oder Verzögerungsvolumen
  • Säulendimensionierung und Kapillarlänge
  • Fluss
  • Teilchengröße

Heute geht es um die Mischkammer: Volumen sowie Geometrie/Design

Zusammenfassung:
Das Volumen aber auch die Geometrie/Design der Mischkammer (Mischer, Mischventil) können einiges beeinflussen: Rauschen und „Buckel“ in der Basislinie, Retentionszeit, Auflösung, Anzahl der Peaks, Auftauchen von Geisterpeaks.

Mischkammer-Volumen und Rauschen

Ein größeres Mischkammer-Volumen führt in der Regel zu einer besseren Durchmischung der Lösungsmittel und folglich zu einem geringeren Rauschen. Das macht sich vor allem in folgenden Fällen bemerkbar: Bei niedrigen Wellenlängen, bei quaternären Pumpen (Niederdruck-Gradient) und bei komplexen Eluenten, die beispielsweise Modifier enthalten (z. B. IP-RP für Oligos). In Abbildung 1 wird das Rauschen bei einer 35 µl- vs. 135 µl- und in Abbildung 2 das Rauschen bei einer 50 µl- vs. 340 µl-Mischkammer gezeigt

Abbildung 1
Basislinie bei einer 35 µl- und einer 135 µl-Mischkammer

Abbildung 2
Basislinie bei einer 50 µl- und einer 340 µl-Mischkammer

Mischkammer-Volumen und Auflösung

Durch ein verändertes Volumen der Mischkammer ändert sich das Verweilvolumen (Volumen von der Mischkammer bis zum Säulenkopf). Und dies hat einen Einfluss auf viele Sachen, u. a. auf die Auflösung. Und weil der Gradient eben recht „tricky“ ist, leider nicht immer einheitlich. In Abbildung 3 wird die Trennung mit einer 1,7 ml-Mischkammer gezeigt: Die Trennung im vorderen Bereich des Chromatogramms ist einigermaßen OK, der Hauptpeak bei ca. 4,6 min sieht ordentlich aus. Bei Verwendung einer 2,6 ml-Mischkammer (Abbildung 4) ist die Trennung zwar vorne schlechter, dafür erscheinen beim Hauptpeak Verunreinigungen, es ergibt sich also just dort eine Verbesserung der Auflösung. Die Peakform von Peak 1 und 2 bleibt in beiden Fällen unverändert.


Abbildung 3
Trennung mit einer 1,7 ml-Mischkammer, Details, siehe Text

 

Abbildung 4
Trennung mit einer 2,6 ml-Mischkammer, Details, siehe Text

Mischkammer-Volumen und Design

Wichtig ist nicht lediglich das Volumen der Mischkammer, sondern auch das Design. Abbildung 5 zeigt eine Trennung mit der Original-400 µl-Mischkammer von Agilent, Abbildung 6 mit einer 10 µl „Lee-Mischkammer“. Obwohl im zweiten Fall das Volumen um Faktor 40 kleiner ist, wird eine nur minimal schlechtere Auflösung im vorderen Teil des Chromatogramms beobachtet. Das heißt: Behalte im Blick nicht nur das Volumen der Mischkammer, ein ausgeklügeltes Design ist mindestens so wichtig für eine homogene Durchmischung der Lösungsmittel: Eine kleine „Säule“ mit Glaskugeln, ein Mischer aus Siebteilchen, ein „Würfel“ mit irregulären Metallstäbchen usw. Übrigens: Das Design entscheidet auch, inwieweit Polymere am Eingang zur Mischkammer entstehen, falls rein ACN gefördert wird; ob also „Buckel“ in der Basislinie erscheinen und ob sich evtl. Druckschwankungen ergeben.

 

Abbildung 5
Auflösung bei Verwendung einer Agilent-400 µl-Mischkammer, Details, siehe Text

Abbildung 6
Auflösung bei Verwendung einer 10 µl-„Lee-Mischkammer“, Details, siehe Text

Mischkammer-Volumen und Retentioszeit, Anzahl der Peaks, Geisterpeaks

In Abbildung 7 wird ein schönes Beispiel von Jürgen Maier-Rosenkranz gezeigt: Zunächst der programmierte Gradient, ferner der tatsächlich resultierende, einmal mit einer 1 ml- und einmal mit einer 2 ml-Mischkammer.

Abbildung 7
Programmierter und tatsächlicher Gradient mit einer 1 ml- bzw. 2 ml-Mischkammer, Details, siehe Text

 

Nachfolgend zusammengefasst, erstens was passiert und zweitens was dies in der Praxis bedeutet:
– Die vorgesehene (programmierte) Spülzeit von 2 min findet aufgrund der
Verzögerung des Gradienten durch das Volumen der Mischkammer gar nicht statt.
Die Säule wird am Ende des Gradienten demnach gar nicht gespült
– Geringere Elutionskraft am Ende des Gradienten; mit der 1 ml-Mischkammer,
ca. 97 % B und mit der 2 ml-Mischkammer ca. 85 % B; es könnte also passieren,
dass dadurch nicht alle Verunreinigungen von der stationären Phase herunter
gespült werden
– Kürzere Equlibrierzeit als die vorgesehene von 7 min: Mit der 1ml-
Mischkammer nur ca. 2,5 min bzw. überhaupt keine Equlibrierzeit im Falle der
2 ml-Mischkammer. Das bedeutet, die nächste Injektion erfolgt, bevor die
Säule im Gleichgewicht gewesen ist.

Merke somit: Bei sonst gleichen Anlagen aber unterschiedlichen Mischkammern müsste man/frau u. U. mit folgendem rechnen – neben einer Veränderung der Auflösung und Unterschieden in der Basislinie/im Rauschen: Verschiebung der Retentionszeit, mehr Peaks, Erscheinen von Peaks beim nächsten Lauf.

sk
2. März 2026
AllgemeinJahrestippsNachweisgrenze

Die kleine Frage zur Validierung …

„Die Kalibrierung wird bei uns nicht von allen gleich durchgeführt. Wir alle erreichen aber meistens einen Korrelationskoeffizient von r = 0,999. Ist dann alles in Ordnung? Oder kann es sein, dass unsere Kalibrierungen doch nicht alle gleich „gut“ sind?“

Vorbemerkung:
Der Korrelationskoeffizient – aber auch das Bestimmtheitsmaß, r2, – ist kein wirklich gutes, oder sagen wir, eher kein besonders aussagekräftiges Kriterium für die Güte einer kalibrierfähigen Methode. Damit werden wir uns jedoch in einem zukünftigen Tipp näher beschäftigen.

Wenden wir uns jetzt der Frage zu: Sollte man/frau bei einem Korrelationskoeffizienten von r = 0,999 sich doch Gedanken machen? Oh ja, denn es sind ja unterschiedliche Praxen zur Aufnahme von Kalibriergeraden denkbar. Und: Diese unterschiedlichen Vorgehensweisen haben kaum einen Einfluss auf den Wert des erhaltenen Korrelationskoeffizienten, zwei bis drei „9“ sind fast immer „drin“. Somit sagen gleiche/ähnliche Werte für r/r2 nichts über die „Qualität“ von Kalibrierungen aus, wenn die entsprechenden Kalibriergeraden anders aufgenommen worden sind. Nachfolgend einige Praxen, die statistisch/analytisch nicht in Ordnung sind, aber dennoch problemlos gute Werte für r/r2 liefern können. Merke: Bei Nicht-Äquidistanz (siehe weiter unten) kann sich sogar ein besserer Korrelationskoeffizient ergeben als die Methode eigentlich hergibt!

  1. Keine äquidistante (gleichmäßige) Abstände der Konzentrationsniveaus, hier einige häufig verwendete Varianten:
  • Zunehmend größer werdender Abstand, z. B:
    2, 5, 10, 20, 50,100
  • Messungen nur im unteren und nur im oberen Konzentrationsbereich, z. B:
    4, 8, 12 und 44, 48, 52. Eine mögliche Begründung – „Ich messe am sinnvollsten bei den problematischen Konzentrationen, also „unten“ und „oben“ – klingt nachvollziehbar, ist aber statistisch nicht korrekt
  • Nicht einmal annähernd gleichmäßige Verteilung der Werte, z. B:
    1, 2, 3, 4, 50, 100. Auch hier eine logisch anmutende, aber statistisch fragwürdige Argumentation: „Bei starken Verdünnungen ist die Streuung der Werte erwartungsgemäß größer, bei höherer Konzentration eher weniger – also nehme ich mehr Werte im unteren Bereich der Geraden auf“
  1. Neun Werte – „3,3,3“, d.h. drei Konzentrationen, drei Werte pro Konzentration – suggeriert Sicherheit: Drei Werte pro Konzentration und Ermittlung des Mittelwerts; statistische Relevanz bei drei Werten ist jedoch nicht gegeben. Und: Drei    Konzentrationen sind zu wenig, fünf sollten es schon sein
  2. Ein-Punkt-Kalibrierung
    – 0-Punkt wird angenommen und nicht gemessen
    – 0-Punkt wird zwar gemessen, aber nur mit Lösungsmittel und nicht mi einer Placebo-/Matrix-enthaltenen Lösung
  3. Die Gerade wird extrapoliert
    Es werden Lösungen bestimmter Konzentrationen gemessen, dann „zieht“ der Rechner die Gerade bis zum 0-Punkt; gerade Werte bei niedrigen Konzentrationen sollten jedoch gemessene und keine errechnete/extrapolierte Werte sein!

Ich möchte zum Schluss noch auf folgende Sache hinweisen: Oft werden für die Kalibriergerade Standardlösungen verwendet. Gehen wir zunächst davon aus, dass spätestens bei der Validierung der Einfluss der Matrix auf das Signal nachträglich überprüft wird. Denn passiert dies nicht, so wird bei Verwendung von lediglich Standardlösungen die Linearität des Detektors oder bestenfalls des Gerätes aber nicht der Methode ermittelt. Ein evtl. vorhandener Matrix-Effekt bliebe im Verborgenem.
Nun, wie ist die Handhabe bei der anschließenden Messung von realen Lösungen? Wird die Wiederfindungsrate nur bei einer (Ziel)Konzentration oder bei mehreren überprüft? Welche mögliche Differenz der zwei Signale „Standard- vs. realer Lösung“ wird akzeptiert: Eine absolute Differenz, so und so viel Prozent Abweichung oder wird überprüft, ob der Wert der realen Lösung sich im Vertrauensbereich des Wertes der Standardlösung bei gleicher Konzentration befindet? Und wenn letzteres passiert, wird der Vertrauensbereich bei 95 % oder 99 % berücksichtigt? Nun, das alles ist dem Korrelationskoeffizienten (oder r2) recht „egal“, er liefert weiterhin brav sein zwei bis drei „9“ …

Fazit:
Der Korrelationskoeffizient ist eine zähe Zahl. Unterschiedliche Praxen beeinflussen diese Zahl minimal. Sollen Ergebnisse, auch in einem etwas erweiterten Zusammenhang verglichen werden, z. B. Ringversuche, gleiche Methode aber einmal Gehalt, einmal Reinheit, unterschiedliche Matrices etc.? Wenn ja, und wenn wirklich analytische Gesichtspunkte im Vordergrund stehen sollten:
In solchen Fällen sollte erstens das Handling inkl. den Kriterien z. B. bzgl. Abweichungen völlig identisch sein.
Zur Beurteilung bedürfte es zweitens anderen Tests und statistischen Kriterien als lediglich dem Korrelationskoeffizienten z. B. VK, F-Test, Trendtest, Wiederholbarkeit.
Wenn andererseits seit „ewig“ geltenden, formalen Vorgaben nicht zur Disposition stehen: Natürlich bleibt in solchen Fällen als Kriterium der Korrelationskoeffizient. Denn alle Beteiligte lieben ihn, akzeptieren ihn, kommen seit langem mit ihm aus  verständlichen Gründen (…) hervorragend aus – „so, what?“ Hier besprochene Problematik ist übrigens vor allem im unteren Konzentrationsbereich, also in der Nähe der Bestimmungsgrenze (LOQ) besonders kritisch. Aber unter Umständen auch bei hohen Konzentrationen, d.h. kurz vor Überladung des Detektors.

sk
2. Februar 2026
AllgemeinJahrestipps

Die kleine Frage zur Validierung …

Unser Kunde sagte: „Ich brauche für meinen Kunden eine Methode mit einer guten Präzision und ohne Ausreißer – alles andere interessiert mich nicht.“ Dieser Kunde ist wichtig, hat keine Ahnung und wir wollen ihn zufrieden stellen. Wie machen wir das?“

Zusammenfassung:
Gute Präzision? So klappt´s:
Hervorragende Werte für die Präzision werden bekannterweise durch eine große Anzahl an Werten erreicht; ferner auch, wenn Messpräzision (Streuung der Werte bedingt lediglich durch das Gerät) statt Methodenpräzision ermittelt wird. Noch „krasser“: Keine Injektion aus sechs vials mit je einer Standardlösung, sondern sechs (drei) Wiederholinjektionen aus einem vial.
Sind Ausreißer vorhanden? So sind keine zu befürchten:
Es sollte als Ausreißertest natürlich der Dixon-Test verwendet werden
a) Kleine Anzahl an Werten: Egal wie stark ein Wert abweicht, wird er kaum als Ausreißer zu deklarieren sein
b) Starke Streuung der Werte – keine Probleme
c) Große Anzahl an Werten (mehr als sechs); da der Dixon-Test hier ungeeignet ist, sind auch hier kaum Ausreißer zu „befürchten“

Die Story:
Anfang des Jahres hat manch eine(r) gute Vorsätze für das neue Jahr; einige wollen vielleicht gar „bessere“ Menschen werden. Lasst uns dennoch für einen Moment ein raffiniertes, böses Teufelchen spielen und uns überlegen, wie man einen Unwissenden begeistern kann. Neben legalen, seien einmal ausnahmsweise auch halblegale und moralisch „grenzwertige“ Tricks/Aussagen erlaubt, die jedoch auf den ersten Blick wahrhaftig erscheinen.

Garantiert „gute“ Präzision:

Klassische, legale Vorgehensweise: Viele Werte? Ein kleiner Variationskoeffizient, VK ist mehr als sicher.
Injektion lediglich von Standardlösungen? Da die Geräte heute in der Regel einen hohen technischen Standard aufweisen, ist ein kleiner VK ebenfalls ziemlich leicht zu erreichen.

Test auf Ausreißer – keine Probleme zu befürchten

Ein bekannter Test auf Ausreißer ist der Dixon-Test

Vorgehen: Man bildet die Größe Q nach

Q = | x1 – x2 | / R

x1: ausreißverdächtiger Wert

x2: benachbarter Wert

R : Spannweite (Differenz zwischen kleinstem und größtem
Wert)

Der Ausreißer gilt als erwiesen, wenn der berechnete Wert Q größer ist als ein entsprechender Tabellenwert: Q > Q(P) in der Dixon-Tabelle. Deswegen „Betrag“ in der Formel, weil es um die absolute Differenz zwischen ausreißverdächtigem und benachbartem Wert geht – egal ob sie negativ oder positiv ist.

Die berechnete Größe Q stellt man dem Tabellenwert Q (P) gegenüber:

niP = 0.90P = 0.95P = 0.99
30.890.940.99
40.680.770.89
50.560.640.76
60.480.560.70
70.430.510.64
80.400.480.58

 

P: Signifikanzniveau, d. h. Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit der getroffenen Aussage

ni: Anzahl der Werte

Es hat sich eingebürgert, dass die Werte der Spalte „P=0.99“ zurate gezogen werden: Ein Wert wäre als Ausreißer zu deklarieren, wenn dieser größer als der entsprechende Wert in der Dixon-Tabelle ist: Dieser Wert ist eben zu 99 % ein Ausreißer. Und bei der relativ kleinen Anzahl an Werten, die wir in der Labor-Welt haben, sollte man für eine bestimmte Aussage schon zu 99 % sicher sein (statistische Relevanz bewahrt!)

Beispiel 1

3 Werte: 4,0   6,0   12,0; der Ausreißer-verdächtige Wert ist definitiv die „12“.

Dixon-Text:

6 – 12 : 8 = 0,75

0,75 ist kleiner als 0,99, also muss die „12“ nicht eliminiert werden

Beispiel 2

7 Werte, die recht stark streuen (kleinster Wert 5, größter Wert 14):

7,0   7,8   5,0   8,3   9,0   6,9   14,0
Ausreißer-verdächtiger Wert ist die „14“

Dixon-Text:

9 – 14: 9 = 0,56

0,56 ist kleiner als 0,64, die „14“ ist „kein“ Ausreißer

Beispiel 3

8 Werte, die nicht so stark streuen:

7,0   7,5   8,0   8,5   7,9   8,9   10,0   14,0
Ausreißer-verdächtigter Wert ist die „14“

Dixon-Text:

10 – 14 : 7 = 0,57

0,57 ist kleiner als 0,58, die „14“ ist „kein“ Ausreißer

Bemerkungen:

  • Drei Werte sind zu wenig, um von einer statistischen Relevanz zu sprechen
  • Je stärker Werte streuen, um so unwahrscheinlicher wird es, eine starke Abweichung als Ausreißer zu deklarieren
  • Je größer die Anzahl der Werte, um so ungeeigneter wird der Dixon-Test; bei diesem Test werden ja nur drei Werte für die Berechnung der Prüfgröße Q berücksichtigt: der Ausreißer-verdächtigte Wert, sein benachbarter Wert und der kleinste Wert. Wie viele Werte dazwischen liegen, ist irrelevant. Deswegen sollte ab ca. sechs Werte der Grubbs-Text verwendet werden (Mittelwert, Standardabweichung für die Berechnung)

Eine analytisch seriös, wahrhaftig klingende Aussage vom Teufelchen könnte in etwa wie folgt lauten:

„Lieber Kunde,
wir haben unsere Methode wirklich sehr gründlich getestet: Die Präzision ist wie du hier siehst, hervorragend. Ferner haben wir die Methode selbstverständlich sowohl für eine kleine Zahl (Beispiel 1) als auch für eine große Anzahl an Werten (Beispiel 3) getestet. Wir haben unsere Methode sogar für die schwierigste Matrix getestet, also nicht nur für Apfelsaft, sondern auch für Spinat (Beispiel 2). Es ergab in keinem einzigen Fall ein Ausreißer, unsere Methode ist somit für dich gut geeignet.“

Jetzt verwandeln wir uns von einem Teufelchen zu einem(r) kritischen Beobachter(in): Wenn Sie Daten erhalten, werfen Sie einen kritischen Blick auf diese sowie auf den verwendeten statistischen Test:

  • Anzahl der Werte?
  • Sind diese normal/gleichmäßig verteilt?
  • Passt der Test zu der Intention, zu den Werten: Wie streng will/muss ich sein (Signifikanzniveau 95 % oder 99 %)?

Präzision:
Wenn Sie das Ergebnis eines Tests zur Präzision mit auffallend vielen Werten bekommen: Handelt es sich um eine Methode mit beispielsweise komplexer Probenaufarbeitung (Extraktion, Derivatisierung)? Oder liegt vielleicht eine komplexe Matrix vor (biologische, Lebensmittel- oder Umweltmatrix)? Dann kann eine große Anzahl an Werten gerechtfertigt sein. Ist das nicht der Fall, liegt womöglich ein unnötiger Fleiß vor, oder … Jedenfalls sollte man schon nach dem Grund fragen.

Ausreißertest:
Bei einer kleinen Anzahl an Werten und/oder starker Streuung ebendieser ist das Fehlen von Ausreißern keinesfalls ein Qualitätsattribut der Methode. Und wenn für ab ca. sechs Werten der Dixon-Text verwendet wird, würde ich der Aussage keinen sonderlichen Wert beimessen.

Meine Erfahrung aus diversen Projekten:
– Nicht-zu-Ende gedachten Vorgaben (Notwendigkeit für diese?),
– starker Focus auf formale Anforderungen zu Lasten analytischer Relevanz und
– mangelndes Wissen um die Aussagekraft von statistisch „sauber“ ermittelten Größen …
… führen des Öfteren dazu, dass die Routineeignung einer Methode zu positiv eingeschätzt wird. Seien Sie kritisch und versuchen Sie praxis-nah zu denken (mir fällt es auch oft schwer).

sk
2. Januar 2026
AllgemeinBodenzahlZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Kann ChatGPT mittlerweile „besser“ HPLC? Und wie ist es mit Google oder Perplexity?

Zusammenfassung
Vor zwei Jahren habe ich ChatGPT Wissensfragen zu HPLC gestellt. Viele Antworten waren richtig, es gab aber auch frappierend falsche Antworten. Die gleichen Fragen habe ich jetzt wieder gestellt, Ergebnis:
Bezahlversion ChatGPT; bei klaren Vorgaben („Bitte antworte nach wissenschaftlichen Standards, für ein Fachpublikum und hab´ ein besonderes Augenmerk auf den Praxisbezug im Labor“) gab erstens viel mehr Antworten und zweitens alle bis auf zwei – siehe weiter unten – waren richtig und hilfreich.
Kostenlose Version, Google, Perplexity: Wesentlich kleinere Anzahl von (richtigen) Antworten, daneben auch völlig inhaltslose Aussagen.
Schließlich: Je spezifischer die Frage (z. B. Probleme bei OPA-Derivatisierung), umso spezifischer – wenn auch nicht immer treffsicher – die Antworten. Das gilt für alle hier erwähnten Tools.

Die Fragen: Retentionszeit und Bodenzahl
Eine Frage war: Wie erhöhe ich die Retentionszeit in der RP-HPLC? Lediglich folgende zwei Antworten waren bei der Bezahlversion der ChatGPT falsch bzw. – etwas milder formuliert – ungenau:
Bei Halbierung der Flussrate …
* „… bleibt die Bodenzahl zunächst ähnlich“ (diese Aussage ist nur für ≤ 1,7 µm-Teilchen und kleine Moleküle weitestgehend wahr)
* „… erfolgt keine Änderung der Selektivität“ (das gilt nur für isokratische Trennungen, bei Gradientenläufen kann bei einer Änderung der Flussrate die Selektivität sich sehr wohl ändern)

Kostenlose Version ChatGPT, Google, Perplexity:
Besonders schwierig für die Suche wird es, wenn die Antworten wahrhaftig erscheinen. So lautet eine klassische, falsche Antwort: Bei kleineren Teilchen nimmt die Retentionszeit zu. Erst durch meinen hartnäckigen Einwand, dass – falls dies eintritt – es mit einer größeren Packungsdichte bei den kleineren Teilchen zusammenhängt, waren die Tools anschließend „kleinlaut“. Ebenso hat Perplexity sehr „selbstbewusst“ behauptet, die Erhöhung des pH-Wertes führt zu einer längeren Retentionszeit. Als ich auf saure Komponenten hinwies, kam zunächst die übliche Ausrede – natürlich inkl. dem obligatorischen Lob – und dann erst die richtige Einschränkung …
Hier noch einige Beispiele, bevor ich zum Fazit komme:
Google
• Gradientenlauf: „Ein sehr starker Gradient kann die Retentionszeiten verkürzen. Versuchen Sie stattdessen, den Gradienten zu verlangsamen, um die Retentionszeiten zu verlängern und gleichzeitig die Peaks zu verschärfen“ (Peaks werden bei einem langsameren Gradienten nicht schärfer!).
• Stationäre Phase anpassen: „Verwenden Sie eine stärker polare stationäre Phase. Dies erhöht die Wechselwirkung zwischen Analyten und Säule“ (wohl bemerkt, hier ist von RP-HPLC die Rede!).
* Bodenzahl:
„Eine höhere Flussrate kann erforderlich sein, um die Trennleistung zu maximieren“ (falsch, die Trennleistung/Bodenzahl nimmt bei Flusserhöhung im üblichen Arbeitsbereich ab).
Kostenlose ChatGPT:
„In der Praxis resultiert die größte Effizienzsteigerung meist aus einer Kombination aus sauberem System, optimaler Flussrate und qualitativ hochwertiger Säule – nicht allein durch höheren Druck“ (netter Satz aber nichtssagend!)

Ich verzichte hier auf weitere Beispiele und komme nach der Recherche zum Fazit aus meiner Sicht, im Focus steht hier die Suche von wissenschaftlichen Inhalten:

• Sicherlich bekannt, kann jedoch nicht genug wiederholt werden: Klare Vorgaben, letzten Endes richtiges prompten ist bei einer Suche das A und O
• Je spezifischer die Frage, umso größer die Chance für eine „gute“ Antwort. Vermutlich gibt es weniger, dafür aber qualitativ besseres Datenmaterial zu finden
• Die hier besprochenen Tools (außer Google) erkennen Zusammenhänge; die Qualität der gefundenen Daten im wissenschaftlichen Kontext ist aber nicht immer gegeben. Genau das ist jedoch der Erfolgsschlüssel für die Suche. Und: Offensichtlich sind die verwendeten Algorithmen (noch) nicht in der Lage, wissenschaftliche Zusammenhänge auf den Wahrheitsgrad zu beurteilen. Diese digitalen Assistenten sind (noch) nicht autonom: Autonom heißt ja, gemäß Vorgaben nicht nur selbstständig richtig suchen, sondern die Ergebnisse auch beurteilen; es fehlt einfach ein vorgeschaltetes maschinelles Lernen. Das bedeutet: Es kommt bei einer wissenschaftlichen Suche mithilfe von generativen KI-Tools immer stärker auf das Urteilsvermögen und somit auf das fachspezifische Wissen der Suchenden an, diese Notwendigkeit sollte nicht unterschätzt werden.

Ich wünsche Ihnen einen guten und gesunden Start ins Jahr 2026 (menschliche Aussage, kein Ergebnis einer KI-Suche)

sk
29. November 2025
A FehlersucheACNEluentpH-Wert des Eluenten

Puffer in der RP-HPLC – was sind die wichtigsten Ursachen für mangelnde Reproduzierbarkeit von Retentionszeit und Peakfläche?

Zusammenfassung
Verschiebung des pH-Wertes; kommt Puffer als „Übeltäter“ infrage, so wären folgende drei Ursachen zu nennen: Falsch gewählter Puffer für den gewünschten pH-Wert, geringe Puffer-Konzentration sowie keine gleiche Konzentration von Säure (Base) und korrespondierendem Salz. In den beiden letzten Fällen ergibt sich ein schwacher Puffer.
Die nächsten zwei Punkte stellen zwar keine Fehler im engeren Sinne dar, sie sind dennoch Ursachen für mangelnde Reproduzierbarkeit: Verschiebung des pH-Wertes nach Zugabe des organischen Lösungsmittels und Änderung der Pufferstärke während eines Gradientenlaufs.

Der Fall
Sie übernehmen eine RP-HPLC-Methode, z.B. aus der Literatur, vom Kunden, von den Kollegen aus der Methodenentwicklung. Sie sind sicher, dass Sie keinen Fehler beim Ansetzen der mobilen Phase machen. Dennoch gibt es immer wieder Probleme mit schwankenden Retentionszeiten und/oder Peakflächen. Sie messen den pH-Wert des frischen Eluenten, dann wieder nach ca. 2-3 Stunden und auch den pH-Wert des Eluats (das, was von der Säule herauskommt). Sie erhalten unterschiedliche Werte, also bleibt der pH-Wert nicht konstant. Ergo: Der verwendete Puffer macht keinen guten „Job“. Wann ist dies der Fall?

Die Lösung
Nachfolgend die wichtigsten Ursachen:
1. Der verwendete Puffer ist zu schwach: Je geringer die Konzentration, desto kleiner der pH-Wert-Bereich, in dem der Puffer für einen konstanten pH-Wert sorgen kann, siehe dazu Abbildung 1.

So reicht beispielsweise die Pufferkapazität eines 10 mM Acetat-Puffers aus, um einen pH-Wert-Bereich zwischen pH = 4,5-5,0 abzupuffern, ein 20 mM starker Puffer kann einen pH-Wert-Bereich zwischen pH = 3,8-5,8 und ein 40 mM starker Puffer schließlich einen pH-Wert-Bereich zwischen 3,5-6,0 abpuffern.
Ein weiterer Vorteil von konzentrierten Puffern ist die Verbesserung der Peakform, als Nachteil kann die verkürzte Lebensdauer der Säule sowie die bekannten Probleme mit der Pumpe genannt werden. Ein vernünftiger Kompromiss für kleine Moleküle sind oft 20 mM-Puffer, für Biomoleküle werden wesentlich konzentriertere Puffer benötigt.

  1. Nicht-passende Konzentration von vorliegendem Salz und zugegebener Base (Säure), um einen bestimmten pH-Wert einzustellen. Z. B. liegen 10 mM Natrium-Phosphat oder 10 mM NaOH vor und es wird eine stark-konzentrierte Phosphorsäure zur Einstellung des pH-Wertes verwendet. Die Menge an Salz (Base) ist zu gering, um die zugegebene Säure gänzlich „aufzufangen“, der resultierende Puffer ist demnach ebenfalls ein schwacher Puffer, der pH-Wert verschiebt sich.
  2. Der verwendete Puffer passt nicht zu dem gewählten pH-Wert. Beispielsweise ist Phosphatpuffer für einen avisierten pH-Wert von 4 oder 5 nicht geeignet, er hat in diesem Bereich kaum eine Puffer-Kapazität, siehe Abbildung 2.

Der Phosphatpuffer ist geeignet für folgende drei pH-Wert-Bereiche (ca. +/- eine pH-Einheit um den jeweiligen pKS-Wert):
ca. 1,3-3,1
ca. 6,2-8,2
ca. 11,4-13,4

Nun die zwei weiteren Punkte:

  1. Nach der Zugabe eines organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert – auch wenn ein richtiger Puffer in genügend starker Konzentration vorliegt, siehe Abbildung 3: Betrachten wir beispielsweise einen Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0. Nach der Zugabe von 60 % MeOH ergibt sich ein pH-Wert von ca. 8,5. Auch wenn bei einem derart hohen MeOH-Anteil kaum vom „pH-Wert“ gesprochen werden kann (man müsste mit korrigierten Werten arbeiten …), können wir festhalten, dass der pH-Wert des Eluenten definitiv ins Alkalische driftet – die Säule hält nicht lang. Umgekehrt, liegt ein Puffer bei einem pH-Wert von ca. 9,2 vor, ergibt sich nach der Zugabe von Methanol eine (leichte) Abnahme des pH-Wertes (auf ca. 8,5). Mit ACN verhält es sich analog, die Verschiebung des pH-Wertes fällt allerdings geringer aus.

  1. Wenn Sie sich wirklich einen linearen, „klassischen“ Gradienten wünschen und keinen ungewollt dreifach-Gradienten (Lösungsmittelstärke, Salz, pH-Wert) fahren wollen und ferner eine quaternäre Pumpe zur Verfügung haben, könnten Sie folgenden Trick anwenden:
    Kanal A: Wasser
    Kanal B: ACN
    Kanal C: Puffer, er wird mit 10 % der Gesamtflussrate gefördert, Pufferkonzentration: 10-mal die Endkonzentration im Eluenten, der Gradient wird wie gewohnt gemischt. 

Das Fazit
Einer unbeabsichtigten Verschiebung des pH-Wertes kann durch
– den richtigen Puffer (abhängig vom gewünschten pH-Wert-Bereich)
– einen genügend stark konzentrierten Puffer
– sowie einen Puffer, eingestellt mit gleicher Molarität an korrespondierendem Salz
(Base) und Säure
begegnet werden.

Ferner sollte an die Verschiebung des pH-Wertes beim Gradienten durch die stete Zunahme des organischen Anteils im Eluenten sowie an eine evtl. gleichzeitige Änderung der Pufferkonzentration gedacht werden. Die Konsequenzen bei einer unbeabsichtigten Verschiebung des pH-Wertes können vielfältig sein: Verschiebung der Retentionszeit, Veränderung der Peakform, Veränderung der Peakfläche. Und eine solche Verschiebung/Veränderung kann je nach Struktur der Analyten von marginal bis gravierend ausfallen. Auch eine Änderung der Elutionsreihenfolge kommt nicht selten vor.

sk
1. November 2025
AllgemeinVariationskoeffizient (Vk)Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Die kleine Frage zur Validierung

„Wir erreichen den geforderten VK nicht. Der Kunde will aber nicht, dass wir an der Methode etwas ändern, was können wir tun?“

Antwort:
Einfach mehr Messwerte erzeugen; das klingt einfach, ist es auch, es funktioniert, ist oft das kleinste Übel und manchmal die beste und einzige Möglichkeit, „legal“ den VK (Variationskoeffizient/relative Standardabweichung, engl.: Relative Standard Deviation, RSD) „runterzudrücken“.
Erläuterung:
Die Standardabweichung ist ein Maß für die Präzision, je kleiner die relative Standardabweichung (RSD: Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert), umso präziser die Methode. Wenn ich einen Wert erzeuge, ist die Standardabweichung 1, bei vier Werten ist sie 0,5 usw., siehe in der Abbildung die Abnahme der Standardabweichung mit der Anzahl der Messwerte.

Irgendwann lohnt sich der Aufwand allerdings nicht: Ob 20 oder 25 Messwerte – das macht beim VK kaum was aus. Aus der Abbildung wird ebenfalls ersichtlich, warum in der Analytik die Anzahl der Werte oft zwischen ca. 6 und 10 liegt: Das ist ein vernünftiger Kompromiss zwischen Aufwand und kleinem VK.
Wann sind ca. 10 Werte angebracht?
Im Falle einer komplexen Matrix (z. B. biologische Matrix, Lebensmittel-/Umwelt-Probe), da hier die Messwerte erfahrungsgemäß recht stark streuen. Oder auch wenn durch die Probenvorbereitung die Werte ebenfalls stark streuen können, z. B. Derivatisierung, Extraktion.
Wann sind ca. 6 Werte angebracht?
Im Falle einer einfachen Analytik und einer klaren, einfachen Probelösung, z. B. Wirkstoffanalytik in der Pharma.

Natürlich kann und wird auch vielfach der VK mit 3 Werten ermittelt. Die statistische Relevanz bleibt jedoch in solchen Fällen nicht gewahrt.

Weiterführende Infos zum Thema „Validierung“:

Artikel, Dokumente, Definitionen, Beratung, Bücher: https://www.kromidas.de/validierung/

Kurse:
Kompakter 1-tägiger Kurs „Das 1 x 1 der Validierung“ als firmeninterne Schulung (Online oder Präsenz) https://www.kromidas.de/das-1×1-der-validierung/

2-tägiger Intensivkurs „Chromatographische Methoden „richtig“ validieren“, als firmeninterne Schulung (Online oder Präsenz): https://www.kromidas.de/chromatographische-methoden-richtig-validieren/
Als offene Online-Schulung: https://seminare.provadis.de/seminare/seminar/2/700/31570

sk
1. Oktober 2025
AllgemeinEinstellparameterNachweisgrenze

Die kleine Frage zur Validierung …

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“

Antwort:
Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist.
Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.

 

Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle:

  • Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom)
  • Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können dabei recht stark abweichen, siehe z. B. die Werte der zwei Spalten bei Empower und Chromeleon (Waters, Dionex/Thermo). Das betrifft nicht nur absolute Abweichungen, es können sich sogar sowohl Unter- als auch Überbefunde ergeben
  • Erst ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 ist bei allen kommerziellen CDS (Chromatography-Data-Systems) der Integrationsfehler merklich kleiner 1 %

Fazit bzgl. Richtigkeit – wenn das Ziel zuverlässige Ergebnisse lautet:
– Bei symmetrischen, BL-getrennten Peaks liegt der Fehler durch die Integration erst
ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 gesichert unter 1 %
– Bei tailenden, Nicht-BL-getrennten Peaks – evtl. noch auf einer driftenden Basislinie –
ist ein S/N-Verhältnis von ca. 100:1 empfehlenswert.

Auch die Reproduzierbarkeit der Integration bei mehrfacher Injektion (Präzision) lässt bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 oft zu wünschen übrig.

Empfehlung bzgl. Reproduzierbarkeit von Ergebnissen am LOQ:
Injizieren Sie sechs Mal eine reale Probe und ermitteln bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 den Variationskoeffizienten (VK, RSD, Relative Standard Deviation). Frage: Genügt der resultierende VK bei diesen chromatographischen Bedingungen an dieser Apparatur und bei diesen Settings Ihren Anforderungen? Wenn nicht, wäre das S/N-Verhältnis so lange zu erhöhen, bis dies der Fall ist. Diese Konzentration kann dann als gesichert reproduzierbares LOQ (Limit Of Quantification, Bestimmungsgrenze) angesehen werden, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wäre somit gegeben: Ihre Software kann bei dieser Konzentration reproduzierbar integrieren. Ein möglicher systematischer Fehler („Unrichtigkeit“ der Peakfläche und somit des Gehaltes) bleibt natürlich unerkannt, siehe dazu weiter oben „Richtigkeit“.
Merke:
Das in einigen regulierten Bereichen (FDA, ICH etc.) etablierte S/N-Verhältnis von 10:1 als Kriterium für LOQ basiert auf Richtlinien, es sind keine unverrückbare/gesetzliche Vorgaben: Es handelt sich ja um „Guidelines“ und nicht um „Regulation“/“Legal Requirements“. Es zeigt sich, dass mit Begründung ein größeres S/N-Verhältnis als Kriterium für LOQ von Auditoren/Inspektoren durchaus akzeptiert wird.

sk
1. September 2025
AllgemeinNachweisgrenze

Die kleine Frage zur Validierung …

„Validierung ist aufwendig und teuer; was ist das Minimum an Validierung, was wir machen müssen?“

Zwei Vorbemerkungen
Vor einer Antwort halten wir wie folgt fest:
1. Es gibt viele Definitionen zur Validierung, eine davon lautet: „Das Ziel bei der Validierung einer analytischen Methode ist zu zeigen, dass sie für den beabsichtigten Zweck geeignet ist.“
2. Validierung ist – anders als z. B. GLP – kein Gesetz. Es gibt demnach de jure keine offizielle Stelle, die bzgl. Umfangs, Validierungstiefe, Durchführung, Revalidierungbedarfs etc. gesetzlich bindende Vorgaben macht.

Somit jetzt schon einige Schlussfolgerungen:

  • Validierung ist demnach etwas recht Individuelles: Um was geht es in einem aktuellen Fall eigentlich? Muss ich eher formale Sachen beachten, muss also eine wichtige Person/Organisation lediglich „nicken“? Oder stehen analytische Gesichtspunkte im Vordergrund, die notwendiger-/sinnvollerweise zu beachten sind?
  • Sehr wohl ergibt sich häufig de facto aus bestimmten Zwängen/Gegebenheiten genau „was“, „wie“, und „wieviel“ an Validierung zu tun ist. Wenn ich diese Vorgaben missachte, bekomme ich beispielsweise keine Zulassung für mein Produkt bzw. kann ich besagte Methode gar nicht anwenden. Wenn ich solchen Zwängen nicht unterliege, kann ich selbst denken und dem „beabsichtigten Zweck“ gemäß handeln.
  • Das heißt, ich suche aus der „Validierungsklaviatur“ (Richtigkeit, Präzision, Linearität, Robustheit etc.) diejenigen Validierungsparameter aus, die ich für den konkreten Fall – Eignung der Methode für den beabsichtigten Zweck – als entscheidend identifiziere. Diese werden dann in dem Umfang und in der Validierungstiefe, die ich als dienlich erachte, geprüft.

Drei Beispiele zu der Frage, wer über Umfang und Durchführungsmodus letzten Endes bestimmt:

  • Ich bin dabei, eine Methode für einen Kunden zu validieren, der lediglich von mir hören möchte, dass die von mir entwickelte Methode „validiert“ ist – mehr interessiert ihn nicht. Hier habe ich zu denken, was zu tun ist, um – mit möglichst geringem Aufwand – Gefahr für den Kunden abzuwenden
  • Der (hoffentlich) fachkundige Mitarbeiter einer Nationalbehörde sagt mir, was er erwartet – das habe ich sinnvollerweise genau zu befolgen
  • Ich arbeite in einem stark regulierten Bereich, z. B Pharma; wenn ich gemäß den ICH-Richtlinien (bei Beachtung der Spielräume!) validiere, werde ich bzgl. Validierung definitiv kaum Probleme bekommen

Nachfolgend vier Beispiele, die aus analytischer Sicht sowohl einen individuell notwendigen Umfang als auch eine notwendige Validierungstiefe bedingen:

  • HPLC-Methode für einen Textilfarbstoff
  • HPLC-MS/MS-Methode für einen hochtoxischen Metaboliten in Human-Serum
  • Quantitative Erfassung mittels GC-MS aller vorhandenen Pestizide einer Mülldeponie-Probe
  • Gehaltsbestimmung eines Wirkstoffs in einer klaren Lösung mittels HPLC-UV

Es handelt sich hier um vier völlig unterschiedliche Situationen:

Zu 1: Es ist ziemlich unwichtig, ob mein Pulli etwas mehr oder etwas weniger
rot ist …
Zu 2: Hier ist höchste Sorgfalt gefragt, es geht schließlich um Menschenleben
Zu 3: Sehr, sehr aufwendig und vermutlich langwieriger Validierungsaufwand
Zu 4: Wahrscheinlich einfach und zügig durchzuführen

Antwort:
Nachfolgend drei Beispiele für eine „Mini-Validierung“, die völlig in Ordnung wäre:

  • Sogenannte „Ergebnisvalidierung“; ich beweise, dass für diese Konzentration in dieser Matrix die geforderte/erwartete Präzision und Richtigkeit gegeben ist – fertig
  • Ein neuer Lieferant bietet mir einen bestimmten Rohstoff sehr günstig an; es reicht, wenn ich sehr (!) gründlich die Selektivität bestimme: Ist die von mir spezifizierte Reinheit gegeben? Fertig.
  • Ich möchte, dass mein Geschäftspartner (Lohnhersteller, outgesourcte Qualitätskontrolle usw.) zuverlässige/validierte Ergebnisse erzeugt. Ich schicke ihm die Methode mit definierten Anforderungen und schaue, ob er die geforderten Ergebnisse/Anforderungen gemäß einer praktikablen, statistischen Relevanz erzielen kann. Tut er das? Das reicht.

Abschließendes Fazit, wobei der erste Punkt der wichtigste ist:
– „Verstehe“ was das eigentliche Ziel der Validierung in diesem Fall ist
– Entscheide demnach über Umfang und Details zur Durchführung
– Dokumentiere gründlich alles Relevante

Durch diese systematische Handlungsweise wirst du wahrscheinlich keinen groben Fehler bzgl. Validierung machen. Du wirst jedenfalls mindestens eine solide Basis geschaffen haben; evtl. notwendige Ergänzungen und Anpassungen dürften später leicht umzusetzen sein.

sk
7. August 2025
B OptimierungChromatogrammDetektorLC-MS-KopplungOptimierung

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Das Nonplusultra zur Überprüfung der Peakhomogenität: Multidetektion und 2D-Chromatographie

Zusammenfassung

Multidetektion und insbesondere 2D-Chromatographie sind die besten Tools, um Peakhomogenitäten zu überprüfen bzw. mittels letzterer die Auflösung zu verbessern. Der Aufwand jedoch bei der Etablierung einer 2D-HPLC sollte nicht unterschätzt werden. Ferner sind zwei Nachteile bei 2D-Anwendungen zu nennen: Mangelnde Robustheit und Verlust an Empfindlichkeit.

Der Fall

Beim letzten HPLC-Tipp haben wir uns den orthogonalen Test angeschaut: Eine gänzlich andere Säule und/oder ein gänzlich anderer Eluent sind sehr hilfreich, um die Peakhomogenität (Peakreinheit) zu überprüfen. Heute geht es um die in diesem Zusammenhang vermutlich zwei besten Tools:
Stufe 1, recht einfach: Einsatz eines zweiten/dritten Detektors; Multidetektion ist mittlerweile in vielen Laboren eine Selbstverständlichkeit
Stufe 2, recht aufwendig: „2D“ (2-dimensionale Chromatographie) anwenden; 3D gibt es zwar auch schon seit jeher – aber lassen wir es hier lieber …
Was hat denn beides auf sich?

Die Lösung

  1. Multidetektion

Ein zweiter/dritter Detektor in Serie kann erstens Peaks detektieren, die bei Verwendung nur eines Detektors unsichtbar bleiben und zweitens Peaks, die schlecht abgetrennt sind, wenigstens als solche erkennen.
In Abb. 1 wird die Verunreinigung bei 6,72 min nur mit MS (ESI-Positiv), jedoch nicht mit DAD erkannt (oberes Bild). Im ESI-Negativ-Modus (unteres Bild) ist zwar das Signal bei 6,72 min wesentlich größer, dafür fehlt jedoch der Peak bei 2,33 min.

Abbildung 1
Durch zwei Detektoren in Serie können mehr Peaks erkannt werden, Details, siehe Text

Fazit 1: DAD-MS/MS mit allen seinen Facetten (mehrere Spektren, zwei Interfaces, zwei Übergänge etc.) ist ein sehr guter Ansatz und seit längerem Stand der Technik

Allerdings: Nicht alle Komponenten sind UV-aktiv und nicht Alle können ionisiert werden. Ein Universal-Detektor wie CAD, der „alles“ sieht oder ein spezifischer und empfindlicher Detektor wie FLD stellen hier sehr gute Ergänzungen dar.
In Abb. 2 wird ein Chromatogramm mit CAD, DAD und MS gezeigt. Mit CAD werden zunächst „alle“ Peaks angezeigt. Die Verunreinigung bei ca. 1,7 min allerdings wird beim UV-Detektor kaum, beim universalen aber unempfindlichen Aerosoldetektor CAD nicht erkannt. Dies ist nur mithilfe der MS-Kopplung der Fall (mittleres Chromatogramm).

Abbildung 2
Die Verwendung mehrerer Detektoren erweitert die Detektierbarkeit chemisch unterschiedlicher Komponenten, Details, siehe Text

Fazit 2: Neben der Kopplung DAD-MS/MS wäre je nach Fragestellung ein weiterer, Universal- oder ein spezifischer/empfindlicher Detektor eine gute Ergänzung, auch dies ist bereits Stand der Technik  

  1. 2D-Chromatographie

Das 2D-Prinzip, stark vereinfacht: Nach der Trennung an einer Säule (erste Dimension, Trennmechanismus A) wird/werden ein Peak/alle Peaks zu einer zweiten möglichst orthogonalen Säule (zweite Dimension, Trennmechanismus B) überführt und dort weiter aufgetrennt.
Die häufigsten Kombinationen sind: HILIC-RP, RP-RP, SEC-IEX, LC-SFC.
Die anschließend üblichen Detektionsmodi sind: MS/MS, IM-MS, ICP-MS.
2D ist nicht neu; Abb. 3 zeigt die 2D-Trennung von Chlorphenolen aus den 1990er Jahren, die zwei orthogonalen Säulen waren Kieselgel und C18.

Abbildung 3
Koeluierende Komponenten unter einem Peak können mittels zweier unterschiedlicher Säulen im 2D-Modus aufgetrennt werden

Abb. 4 zeigt eine 2D-Trennung aus den 1980er Jahren, die Kopplung hier war HPLC-DC (Dünnschicht-Chromatographie): Unter dem letzten HPLC-Peak „D“ befinden sich 18 (!) Komponenten, die mittels DC erkannt werden. Je unterschiedlicher die Trenn-Mechanismen sind, umso größer ist die Anzahl der theoretisch trennbaren Komponenten (Multiplikation der Peakkapazitäten der zwei Trennmodi).

 

Abbildung 4
Unter einem HPLC-Peak können sich mehrere Komponenten verbergen, Details, siehe Text

Natürlich werden viele Leser:innen jetzt denken, „So schlimme Chromatogramme haben wir bei uns erfreulicherweise nicht“, siehe jedoch dazu Abb. 5: Chromatogramm mit zunächst „nur“ 6 Peaks: Man erkennt zwar leicht durch den „Buckel“ beim vierten Peak, dass dieser nicht homogen ist (zwei Peaks, siehe LC x LC-Kopplung, rechts im Bild). Der dritte, völlig symmetrische Peak allerdings enthält drei Komponenten!
Merke: Peaksymmetrie ist verführerisch.

 

Abbildung 5
2D-Chromatographie erhöht stark die Wahrscheinlichkeit, Koelution auch im Falle von symmetrischen Peaks zu erkennen, Details, siehe Text

Fazit 3: 2D mit anschließender Multidetektion ist vermutlich die beste Möglichkeit, die Peakreinheit zu überprüfen, bzw. die Auflösung zu verbessern

Bemerkungen:

  • Seit Jahren bieten alle großen HPLC-Anbieter ausgereifte Hardware-Lösungen für 2D-Trennungen, deren Knowhow sollte gezielt genutzt werden
  • 2D kann nicht von „jetzt auf gleich“ etabliert werden, praktische Herausforderungen (z. B. „Mismatch“ Eluent 2. Dimension u.v.m.) sind nicht vernachlässigbar. Für 2D-Projekte sollten erfahrene Mitarbeiter:innen abgestellt werden, alternativ könnte an die Vergabe einer Bachelor-/Master-Arbeit gedacht werden. Arbeitskreise, die hier fundierte Erfahrungen haben sind: Prof. Michael Lämmerhofer, Tübingen, Prof. Oliver Schmitz, Duisburg-Essen
  • 2D ist hervorragend geeignet, um die Peakreinheit zu überprüfen bzw. die Auflösung zu verbessern. Folgendes sollte allerdings hier nicht vergessen werden: Mit Robustheit wird es „schwierig“ und die Empfindlichkeit nimmt ab.

Weitere Infos zum Thema:

© Dr. Stavros Kromidas

Restliche HPLC-Tipps des Jahres unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

sk
14. Juli 2025
ACNAllgemeinChromatogrammEluentLösungsmittelOptimierungSäuleSäulenauswahlStationäre PhaseVeränderung des Chromatogramms

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Der orthogonale Test: Bester Test bzgl. Nutzen/Aufwand-Verhältnisses zur Prüfung der Peakhomogenität

Zusammenfassung:
Orthogonaler Text: Verwende eine „ganz“ andere Säule (z. B. statt einer C18 nun eine PFP oder eine Mixed Mode) und/oder einen anderen Eluenten (mobile Phase statt mit ACN nun mit MeOH) und injiziere erneut. Ähnliche Substanzen gehen wahrscheinlich (etwas) andere Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Somit offenbart sich, dass ein symmetrischer Peak evtl. doch nicht homogen ist.

Der Fall
In den letzten zwei HPLC-Tipps haben wir folgendes gesehen: Eine Änderung von Einstellparametern („Settings“) sowie „Manipulationen“ der Probelösung stellen schnelle Möglichkeiten dar, die Peakhomogenität zu prüfen. Heute geht es um den orthogonalen Test. Was ist das und was „bringt“ er?

Die Lösung
Am Ende einer Methodenentwicklung kommt häufig die Frage auf: „Habe ich alle Peaks trennen können, oder liegt womöglich irgendwo im Chromatogramm doch eine Koelution vor“? Jetzt kommt der orthogonale Test ins Spiel – die Idee dahinter: Man verwende eine völlig andere stationäre Phase oder einen anderen Eluenten und injiziert erneut. Es ist ziemlich unwahrscheinlich, dass zwei oder drei Komponenten bei Verwendung zweier gänzlich (!) unterschiedlichen Säulen bzw. Eluenten in beiden Fällen völlig gleich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen. Wenn nun mit einem Eluenten an zwei unterschiedlichen Säulen oder mit zwei unterschiedlichen Eluenten an einer Säule sich die gleiche Anzahl an Peaks ergibt, ist dies eine recht starke Indiz für Peakhomogenität.
Merke:
1. Wichtig ist eine echte Orthogonalität – nimm´ nicht lediglich eine andere C18-Säule!
2. Es geht bei diesem Test ausschließlich um die Anzahl der Peaks in beiden chromatographischen Systemen. Die Peakform ist in diesem Zusammenhang völlig unwichtig, ebenso wie eine eventuelle Verschlechterung der Auflösung irgendwo im Chromatogramm

Ich habe solche Tests mehrmals durchgeführt, nachfolgend einige Beispiele aus der Praxis:
In Abbildung 1 wird die Trennung von polaren und apolaren Komponenten an zwei Waters-Säulen gezeigt. Obwohl das CSH-Material (linkes Chromatogramm) eine zusätzliche schwach positive Ladung auf der Oberfläche aufweist und Cortecs (rechtes Chromatogramm) ein „Core Shell“-Material ist, sehen die zwei Chromatogramme recht ähnlich aus.

Abbildung 1
Obwohl beide C18-Säulen recht unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, liegt keine „echte“ Orthogonalität vor, Ergebnis: Ähnliche Chromatogramme, Details, siehe Text

Nur wenn ich den in der Probe vorhandenen polaren Molekülen zusätzliche Ionenaustausch-Wechselwirkungen (Abbildung 2, links, HSS SB ist eine nicht-endcappede Phase), bzw. sehr starke zusätzliche polare Wechselwirkungen anbiete (Abbildung 2, rechts, HSS-PFP ist eine Penta-Fluoro-Phenyl-Phase), kann ich sie trennen.

Abbildung 2
Gleiche Probe wie in Abbildung 1, hier jedoch zwei völlig unterschiedliche stationäre Phasen

Abbildung 3 rechts: Moderne, endcappede Phase, 3 Peaks. Der erste, schmale Peak suggeriert Peakhomogenität. Bei Verwendung einer fluorierten C7-Phase (Abbildung 3, Mitte) bzw. einer alten, kontaminierten, nicht-endcappeden Phase (Abbildung 3, links) sind 4 Peaks zu sehen.

Abbildung 4 links: (schwach) polare C18-Phase, Mitte: Klassische C18-Phase. In beiden Fällen eluiert bei 2,91 bzw. 2,78 min ein symmetrischer, schmaler Peak. Nur durch die Verwendung einer Mixed-Mode-Phase (zusätzliche komplex-fähige Gruppe auf der Oberfläche des Materials) offenbart sich ein weiterer Peak.

Ein letztes Beispiel eines orthogonalen Tests mit unterschiedlichen Säulen: In Abbildung 5, rechts, wird die Trennung von Metaboliten von Antidepressiva an einer Ascentis C18-Säule gezeigt. Durch den Einsatz einer Ascentis C16-Amid-Phase wird ersichtlich, dass der symmetrische Peak Nr. 2 bei knapp 10 min an der C18-Phase in Wirklichkeit zwei Komponenten enthält (Zwei Peaks bei 5 min an der C16-Amid-Phase).

Abbildung 5
Trennung von Metaboliten von Antidepressiva an einer C18- und an einer C-16-Säule, Details, siehe Text

Zum Schluss zwei Beispiele mit zwei unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln:

Abbildung 6, Injektion einer Mischung von polaren Komponenten: In ACN (rechts) 3 Peaks, in MeOH (links) 5 Peaks.

Abbildung 7, rechts ACN: Direkt an der Totzeit Koelution zweier Basen; links MeOH, man erkennt hier immerhin drei Peaks.

Das Fazit
Ein orthogonaler Test (denk´ an eine echte Orthogonalität!) ist ein ausgesprochen gutes Tool zur Prüfung der Peakhomogenität mit einem vertretbaren Aufwand:
1. Schnell realisierbar: Über die Mittagspause die Probe einfach über eine ganz andere Säule laufen und anschließend sich überraschen lassen …
2. Wenn Peakhomogenität bei einer bestimmten Fragestellung ein wirklich wichtiges Thema ist, wäre nach meinem Dafürhalten folgender Aufwand ebenso vertretbarer: Über Nacht statt ACN, MeOH als organischem Lösungsmittel verwenden oder/und 10 % des ACN gegen THF ersetzen und über zwei völlig unterschiedliche Säulen die Probe laufen lassen. Vergleiche am nächsten Morgen lediglich Chromatogramme und Anzahl der Peaks.

 

© Dr. Stavros Kromidas

Restliche HPLC-Tipps des Jahres unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

sk
22. Mai 2025
AllgemeinB OptimierungInjektionsvolumenLösungsmittelpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)polare KomponentenProbenlösungsmittel

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Schnell durchzuführende Tests zur Prüfung der Peakhomogenität – im Focus heute: Die Probelösung (Diluent).

Der Fall

Wie beim vorherigen HPLC-Tipp geht es auch heute um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Beim letzten Mal haben wir gesehen, dass eine Änderung der Einstellparameter („Settings“) durchaus hilfreich sein kann. Heute steht die Probelösung im Focus: Schnell durchzuführende „Manipulationen“ bzgl. Probelösung können ebenso helfen. Welche wären das?

Die Lösung

  1. Verdünne die Probelösung oder injiziere weniger

Wir alle überladen öfters als gedacht die „arme“ Säule. Ergebnis: Verschlechterung der Auflösung. Eine lokale Überladung der Säule macht sich vor allem am Anfang des Chromatogramms bemerkbar; dort eluieren in einem RP-System polare Komponenten, die zusätzliche polare Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase eingehen können („Dualer Mechanismus“). Die Devise lautet: Probelösung, also Diluent, einfach mit Wasser verdünnen oder vielleicht noch einfacher: Weniger injizieren. In Abbildung 1, rechts, wird die Injektion von 20 µl Acetophenon gezeigt: Der erste Peak ist eine Verunreinigung, der zweite die Hauptkomponente Acetophenon. Anschließend wurde lediglich Eluent injiziert, linkes Chromatogramm. D.h. hier wurde der Memory-Effekt ausgenutzt: Es befindet sich häufig ein kleiner Rest der Probe an der Nadel, der nicht immer 100% weggespült wird. Wie man leicht erkennt, ist die Verunreinigung sauber, Acetophenon dagegen nicht: Auch mit 20 µl kann eine Säule lokal überladen sein.

Erfahrene Anwenderinnen kennen nun das und es wird grundsätzlich wenig injiziert, z. B. 5 µl, siehe Abbildung 2. Betrachten wir den Peak bei 3,557 min. Wenn anschließend lediglich 1 µl injiziert wird, erkennt man leicht (siehe rechts das gezoomte Chromatogramm), dass der Peak nicht homogen ist. Sogar 5 µl – natürlich auch abhängig von der Konzentration – können zu viel sein. Ein weiterer Beleg für die Überladung bei der Injektion von 5 µl im vorliegenden Fall ist die kürzere Retentionszeit (3,557 min vs. 4,154 min), denn: Eine Überladung geht meist mit einer Abnahme der Retentionszeit einher. Überladung bedeutet ja, dass bestimmte aktive Zentren an der Oberfläche der stationären Phase belegt sind, die Moleküle finden keinen Platz für eine Wechselwirkung, sie eluieren folglich früher.

 

 

  1. Die Probelösung soll schwächer (in einem RP-System, sprich: Polarer) als der Eluent bzw. der Anfangsgradient sein; verändere auch den pH-Wert der Probelösung!

Betrachten wir in Abbildung 3 den Peak bei ca. 2,203 min, oben links: Bei der Zugabe von einem Neutralsalz (hier KCl) zu der Probelösung wird eine Peak-Aufsplittung beobachtet (unten links). Statt einem Neutralsalz kann auch der für den Eluenten verwendete Puffer benutzt werden (oben rechts), es erscheint ein weiterer Peak. Schließlich kann der pH-Wert der Probelösung verändert werden (unten rechts). Bei Unkenntnis des pKA/B-Wertes der betreffenden Komponente, einfach in ein vial mit der Probe einen „Tropfen“ Säure und in ein zweites einen „Tropfen“ Base dazu tun und jeweils nochmal injizieren.

In Abbildung 4 wird ein weiterer Fall gezeigt, wo lediglich durch eine Veränderung des pH-Wertes der Probelösung eine Verbesserung der Auflösung erreicht wurde.

 

 

  1. Verändere das Probelösemittel

In Abbildung 5 wird ein Chromatogramm gezeigt, einmal mit ACN und einmal mit MeOH als organischem Lösemittel zum Auflösen der Probe. Bei Peak Nr. 1 und 3 spielt die Natur des organischen Lösemittels keine Rolle. Peak Nr. 2 entpuppt sich jedoch als zwei Komponenten, wenn ACN verwendet wird. Auch als schneller Test zur Prüfung auf Peakhomogenität „zwischendurch“ geeignet: Ein „Tropfen“ Iso-OH oder THF zu der Probelösung dazu geben und nochmal injizieren. Bleibt die Anzahl der Peaks gleich?

 

Das Fazit

Verdünnen/weniger injizieren sowie „Manipulationen“ – im positiven Sinne! – der Probelösung stellen schnelle Tests zur Prüfung der Peakhomogenität dar. Und: Die Probelösung verändern geht schneller als den Eluenten verändern.

© Dr. Stavros Kromidas

Restliche HPLC-Tipps des Jahres unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

sk
7. April 2025
AuflösungB OptimierungChromatogrammEinstellparameterLC-MS-KopplungNachweisgrenzeOptimierungpolare KomponentenVeränderung des Chromatogramms

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Einfache Tests zur Prüfung der Peakhomogenität

Der Fall

Im HPLC-Tipp vom letzten Dezember war Peaky am Zweifeln, ob er es wirklich ist: „Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere …“ Es geht also um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Im vorliegenden HPLC-Tipp werden wir uns einfache Tests anschauen, die recht schnell durchzuführen sind: Keine Änderung der chromatographischen Parameter, keine Änderung der Apparatur. In den nächsten HPLC-Tipps werden wir uns sukzessiv mit aufwendigeren Methoden beschäftigen.

Die Lösung

Eine Veränderung von Einstellparameter („Settings“) kann helfen, innerhalb von Sekunden/Minuten die Peakhomogenität zu überprüfen. Es lohnt sich (auch) an solche „banale“, schnelle Möglichkeiten zu denken:

  1. Injektion bei einer anderen (niedrigeren) Wellenlänge, siehe Abbildung 1: Bei 271 nm erscheint der dritte Peak als ein Peak (unteres Chromatogramm), bei 225 nm sind zwei Peaks zu erkennen (oberes Chromatogramm)

 

2. Eine große Zeitkonstante („Filter Response“, „Filter Time Constant“) führt zwar zu einer ruhigeren Basislinie, die Peakbreite nimmt allerdings zu, man verliert an Auflösung. Folgendes Zahlenbeispiel aus einer „Technical Note“ von Waters, die freundlicherweise von Sascha Schifrin zur Verfügung gestellt wurde:
Kein digitales Filtern: Auflösung (Resolution) 3,16, Peakkapazität 16
Zeitkonstante, 0,5 Min: Auflösung 1,82, Peakkapazität 12

In Abbildung 2 werden beim Ausbleiben der Glättung – also kein digitales Filtern (quasi ein „ehrliches“ Chromatogramm) – bei 0,25 Min drei Peaks erkannt, bei einer Zeitkonstante von 0,7 Min nur ein Peak. Kommentar: Bei den modernen Geräten wird auch bei kleinen Zeitkonstanten kaum ein signifikant größeres Rauschen beobachtet.

  1. Ähnlich verhält sich die Datenrateaufnahme („Sample Rate“): Je höher die Anzahl der Datenpunkte, umso besser die Auflösung, umso stärker das Rauschen und umso schlechter die Reproduzierbarkeit der Peakfläche bei Wiederholinjektionen. In Abbildung 3 wird an der ansteigenden Flanke des ersten Peaks ein „Buckel“ bei 10 Hz erkannt, bei 2 Hz nicht.

 

4. Je größer der Spalt („Slit“) in nm beim PDA umso mehr Licht geht dadurch, umso besser die Empfindlichkeit, umso geringer die spektrale Auflösung. Das heißt, wenn ich eine gute Empfindlichkeit brauche (Reinheit, „winzige“ Peaks), sollte ich einen großen Wert für den Spalt wählen; möchte ich Spektren aufnehmen, sollte der Wert klein sein, z. B. 1,2 nm. In Abbildung 4 wird ein „Buckel“ am ersten großen Peak nach der Totzeit bei einem Spalt von 16 nm erkannt, nicht jedoch bei 8 nm, geschweige denn bei 4 nm. Bei kleinen nm-Werten verliert man also an chromatographischer Auflösung.

 

5. Erste und zweite Ableitung des betreffenden Peaks; diese Möglichkeit ist auch eine sehr schnelle, deswegen erwähne ich sie, obschon das Ergebnis nicht immer eindeutig ist. Als Ergänzung kann sie allerdings hilfreich sein. In Abbildung 5 zeigt der Peak (schwarz) ein leichtes Tailing. Wenn ein Peak homogen ist (UV-homogen …) sind die beiden Schenkel der 2. Ableitung (hier blau) gleich groß. Das ist hier nicht der Fall, möglicherweise handelt es sich um die Elution einer Verunreinigung am Tailing.

Bemerkung:

Der Einfluss der Einstellparameter macht sich vor allem bei kleinen, früh-eluierenden Peaks bemerkbar.

Einige Empfehlungen:

Zeitkonstante: 50 msec
Dwelltime bei LC-MS: 20-40 msec; längere Verweilzeiten führen zwar zu einer niedrigeren Nachweisgrenze aber auch zu einer niedrigeren Auflösung des Massenspektrums (analog dem Spalt beim PDA)
Datenrateaufnahme: HPLC, 10 Hz, UHPLC, mindestens 20 noch besser 50-100 Hz
Spalt: Aufnahme von UV-Spektren? Verwende 1,2-2 nm. Gute Empfindlichkeit (indirekt auch gute Auflösung) gewünscht? Verwende 16 nm
Wellenlänge: Naturgemäß abhängig von der Struktur, bei Verdacht auf polaren Molekülen tendenziell eher niedrige Wellenlängen

Das Fazit

Eine Änderung von Einstellparametern ist eine Sache von Sekunden, eine Peakinhomogenität kann evtl. dadurch schnell erkannt werden.

© Dr. Stavros Kromidas

sk
19. Februar 2025
Doppelpeakskleine PeaksSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Wahre HPLC-Geschichten zum Schmunzeln: Müßiggang, Wundersäule, „DL-Benzol“

Lassen Sie uns das neue Jahr etwas entspannt und locker angehen; der erste HPLC-Tipp des Jahres 2025 beschreibt drei, sagen wir, „spezielle“ Situationen aus dem echten HPLC-Leben.

„The Beauty of Slowness“

Ein Labor beim deutschen Mutterkonzern hat viele Proben zu messen, die‘
Geräte laufen rund um die Uhr, die Anwenderinnen sind froh, dass sie das
Probenaufkommen gerade noch bewältigen. Im Labor eines
Tochterunternehmens in einem anderen Kontinent, welches die gleiche HPLC-
Methode anwendet, herrscht eine etwas andere Arbeitskultur:
Jeden Freitagnachmittag lässt man die Arbeitswoche mit ausgiebigem
Plaudern bei Kaffee und Kuchen ausklingen, die restlichen Proben können ja
ruhig am Montag fertig gemessen werden… Während der geselligen Zeit
allwöchentlich freitags werden allerdings die Geräte immer sehr lange,
sehr gründlich mit heißem Wasser und Isopropanol gespült, diese
Lösungsmittel (manchmal auch zusätzlich 0,01 N HNO3 und DMF) werden
auch mehrmals injiziert. Im ersten Labor: „Buckel“ in der Basislinie,
Geisterpeaks, Memory-Effekt. Im Zweiten: Null Probleme; Gerät, Autosampler
und Säule werden ja regelmäßig gründlichst gespült, allerlei Verunreinigungen
verlassen zwangsläufig das Gerät – gemütliche Zeit während der etwas
Vernünftiges passiert, ist eine doppelt gewinnbringende Zeit.
Merke: Im Falle einer schwierigen Matrix (Salbe, Tween, Cellulose, Lipide
usw.) bleibt ein gründliches Spülen der Anlage inkl. Säule mit
Lösungsmitteln geeigneter Polarität trotz Zeitdruckes leider nicht aus,
wenn Probleme vermieden werden sollten.

Man soll doch diese gute Säule bestellen können …

Eine Anekdote eines Kollegen: Einige Zeit nach einer Messe erhielt ein bekannter Säulenanbieter eine wütende E-Mail eines Kunden, in etwa: Er habe vor kurzem eine Säule gekauft, aber sie war so schlecht, dass sie mehrere Peaks produzierte, während eine andere „gute“, gleichen Typs einen einzigen fantastischen Peak lieferte. Was war? Auf jener Messe hatte besagter Besucher – ein HPLC-Newcomer – eine Säule vom Stand dieses Säulenanbieters mitgehen lassen. Zu Hause hat er mit seiner Probe einen tollen Peak erhalten also hat er eine weitere Säule bestellt und wollte diese Methode nun im Unternehmen etablieren, nur: Die Säule am Stand war eine leere …
Merke: Betrachte ein zu schönes Ergebnis bei einer unbekannten Probe stets mit äußerster Vorsicht.  

„DL-Benzol“ – oder: Der verpatzte Traum vom Nobelpreis

In meiner Doktorarbeit hatte ich mehrere stationären Phasen für chirale Trennungen entwickelt. Eine mit L-Prolin als chiralem Selektor sah besonders vielversprechend aus: Von diversen Aminosäuren über Thyroid-Hormonen bis hin zu mehreren Wirkstoffen habe ich alle racemische Gemische in die D- und L-Form trennen können: Ich bekam stets zwei Peaks, war unheimlich froh. Das Ganze kam mir aber irgendwann ob dieses Glücks doch suspekt vor, also habe ich einfach Benzol injiziert. Ich bekam auch hier zwei Peaks. Dann wurde mir klar: Entweder habe ich mit „DL-Benzol“ die größte Entdeckung meines Lebens gemacht oder es stimmt etwas nicht. Leider war das zweite der Fall: Ich habe die Säule umgedreht und ich erhielt bei den meisten Racematen – und natürlich auch mit Benzol – nur einen Peak: Am Säulenkopf ist wohl ein „Loch“ im Packungsbeet entstanden – der Nobelpreis muss warten …
Merke: Doppelpeaks oder starker „Buckel“ bei allen Peaks kann eine „Delle“ in der Packung am Säulenkopf bedeuten; Säule umdrehen hilft oft – jedenfalls für eine Zeit lang.  

© Dr. Stavros Kromidas

sk
12. Januar 2025
BodenzahlChromatogrammPeakverbreiterungZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

HPLC und KI mal „anders“: Ein Gespräch zwischen Peaky und Chromy

„Wer bin ich? Und bin ich allein? Und wieso verändere ich mich?

(Peaky ist ein kleiner, unruhiger, quirliger Peak, häufig als „Nervensäge“ unterwegs. Chromy dagegen ist ein großer, gemütlicher Peak aus der Nähe von Hydrophobenhausen, in der Regel cool, fast apathisch. Sie sitzen heute wieder im Karussell am aller letzten Platz und warten bis sie injiziert werden, haben also genügend Zeit für ein Schwätzchen)

Die Probleme von Peaky

Chromy: Peaky, was ist los mit dir, warum bist du so down?
Peaky: Ich bin am Zweifeln: Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere und wieso gehe ich so auseinander, mein Gewicht bleibt doch gleich?
Chromy: Also, ich kann dir garantieren, du bist es und du bist allein, das sehe ich doch …
Peaky (energisch): Dein Freund DAD behauptet es auch. Am Freitag hat er auch nur einen Peak gesehen, aber neben 2-Nitroanilin waren auch 20 % 4-Nitroanilin dabei…
Chromy: Ja, aber …
Peaky (schon etwas erregt): Nix aber! Es geht um MICH Mann, es geht um Wahrheit, kein formales Alibi-Zeugs und so!
Chromy: Beruhige dich doch…
Peaky: NEIN!
Chromy: Aber ich kenne dich und ich sehe dich und …
(Peaky unterbricht ungeduldig): Und wenn du mein Spiegelbild, mein anderes, mein böses „ich“ siehst? Die C18-Tante dachte vorgestern auch, sie sieht L-Carnitin, aber es war D-Carnitin …
(Chromy verliert ein wenig die Geduld …): Mein Gott, du bist mir einer … (… merkt aber direkt, dass er doch ein wenig zu heftig wurde und rudert zurück): Na komm mein Lieber, was hast du denn noch für ein Problem?
Peaky: Ich gehe auseinander …
Chromy: Nun ja, das weiß ich doch und das habe ich dir immer schon gesagt: Schuld daran sind auf der einen Seite diese Metallos drumherum und diese Silanolies auf der Vial-Oberfläche und auf der anderen Seite deine freie Elektronies und deine Hydroxylies und die sonstigen Polaries überall an dir.
Peaky: Meinst du wirklich? Ich kann aber nichts dafür, meine Natur ist halt so …
Chromy: Ich weiß, ich weiß, du kannst nicht anders; sobald du solche Groupies entdeckst, gehst du mit denen innig-heftige Beziehungen ein und wirst dann halt breit und schleppst dich hin.
Peaky: Das stimmt, das gebe ich zu; du hast gut lachen, du bist ja als emotionsloses, pardon, als apolares Wesen die Ruhe selbst, dich interessieren nur diese komischen Alkylies an deiner geliebten C18-Tante.

Lösungsansätze (?) der modernen HPLC

Chromy: Wohl wahr; aber ich kann dich beruhigen, die Lösung deiner Probleme naht!
(Peaky macht ein ungläubiges Gesicht mit mindestens 10 Fragezeichen in den Augen)
Chromy: Fangen wir mit deinem dritten Problem an: In Bälde wird es eine 100 % metallfreie HPLC-Anlage geben – von der Ansaugfritte über die Säule bis hin zur UV-Zelle bzw. MS-Interface – und die Vials werden sowieso alle eine echt inerte Oberfläche haben. Also keine Probleme mehr mit Metallos, Silanolies etc.
Peaky: Ja?
Chromy: Ja! Dann kommt die KI (der sonst phlegmatische und coole Chromy bekommt glänzende Augen und nimmt Fahrt auf) und löst all deine Identitäts-Probleme, weil …
Peaky: (Mit einem noch ungläubigeren Gesicht – als würde man ihm für 9,99 € eine Police mit 100%iger Garantie auf den Haupt-Lotto-Gewinn verkaufen wollen –unterbricht Chromy und murmelt leise): Das wurde uns schon von diesen IMS´s und Q-TOF´s und ORBI-TRAP´s versprochen (die Melancholie macht sich wieder beim ihm breit…). Und wenn ich doch viele bin, weißte, Isobare und so. Und was dich betrifft, bist du ja so fettig-lipid, dich kann man gar nicht ionisieren. Wir arme Schweine können beide gar nicht wissen, wer wir sind und wie viele wir genau sind.
Chromy: Komm jetzt, so schlimm ist es nun wirklich nicht, es gibt doch Universaldetektoren wie dem CAD, die sehen uns …
Peaky: Und welchen Molekulargewichtsbereich decken deine tollen Aerosoldetektoren ab – äh??? Komm, hör auf, mit solchen Versprechungen braucht mir niemand mehr zu kommen!

Kann KI die Lösung sein?

(Chromy ist aber in seiner Euphorie nicht zu stoppen): Nicht morgen, aber in spätestens 5 Jahren wird die KI folgendes können: Ein Mensch hat einen Wunsch – er weiß zwar nicht, dass die KI ihm diesen „zugeflüstert“ hat – welche Eigenschaften eine bestimmte Substanz haben sollte. Die KI synthetisiert nun diese Substanz. Sagen wir, sie hat dich, lieber Peaky, kreiert.
(Peaky wird langsam rot wie eine reife Tomate, aber er geduldet sich)
(Chromy fährt fort): Die KI weiß alles, aber wirklich alles über dich, sie hat ja dich „gemacht“: Wann/wie du dich verhältst, wie du tickst usw. – eben alles. Also weiß sie, wie du zu erfassen und zu identifizieren bist – auch unter Tausenden von anderen Species und auch in den komplexesten Matrices. Denn mindestens eine Sache ist dir eigen und das reicht der zukünftigen KI. Also, du wirst bestimmt und brauchst nicht mehr analysiert zu werden; somit werden alle genau wissen, wer du bist, dass du es wirklich bist und wenn du dich veränderst, warum du dich veränderst. Und …
(Peaky unternimmt einen vagen Versuch, Chromy zu unterbrechen – keine Chance, also macht er gezwungener Weise den Mund wieder zu)
(Chromy fährt fort) … und wenn irgendein gestriger, konservativer Chromatographeur dich doch unbedingt klassisch analysieren wollen würde – was soll´s: Die KI prognostiziert 100 %, bei welchen chromatographischen Bedingungen du bei welcher Retentionszeit eluierst und wie dein Detektor-Hologramm – also deine ureigene Detektormatrix mit allen deinen spezifischen Detektions-Werten – genau aussieht und …
(Peaky unterbricht): Und das soll wirklich kommen?
Chromy: Klar doch!
Peaky: Also braucht man bald kein chromatographisches Wissen mehr, man wird das Denken outsourcen können?
Chromy: Klar doch!
Peaky: Und Wissenschaftler brauchen nur Wünsche der Gesellschaft wissenschaftlich zu formulieren?
Chromy: Klar doch!
Peaky: Nein!
Chromy: Doch!
Peaky: Nein!
(Ruhe …)
(Chromy, der Besonnene): Weiß du was? Lass uns doch jetzt um die Weihnachtszeit herum und um den Start ins neue, glückliche (…) Jahr lieb und friedlich zueinander sein und uns auf einen Kompromiss bzgl. Zukunft einigen:
Der Mensch will etwas – unabhängig davon woher dieser Wille kommt und ob sein Wille sein „freier“ Wille ist. Anschließend bekommt er dies von der KI mit samt den spezifischen Informationen. (Chromy atmet tief und hebt vielsagend Augenbrauen und Zeigefinger hoch): Und halten wir fest mein lieber Peaky: KI ist und bleibt lediglich ein Tool – zwar ein sehr, sehr, sehr leistungsfähiges, aber eben nur ein Tool. Der Mensch also verwertet sämtliche Informationen zu seiner „Bestellung“ – selbstverständlich mit ihrer Hilfe – dabei denkt er natürlich frei und kreativ und auch um die Ecke. Dann lässt er das Ergebnis in seinem Sinne von der KI verifizieren, das letztendliche OK aber kommt zweifelsfrei von ihm, kannst du damit d’accord gehen?

(Peaky nickt – zwar recht zögerlich aber immerhin, er nickt – und sie wünschen sich herzlichst Frohe Weihnachten und ein für alle Menschen und alle anständigen Peaks gutes Jahr 2025).

© Dr. Stavros Kromidas

Weitere HPLC-Tipps von diesem Jahr finden sich unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

sk
30. November 2024
A FehlersucheACNApparaturBodenzahlPeakverbreiterungpolare KomponentenVeränderung des Chromatogramms

Metallionen in der HPLC: „Schlimm“? Und wenn ja, wie schlimm?

Der Einfluss von Metallionen in der HPLC ist schon seit Längerem bekannt; sprechen wir eher von einem zwar vorhandenen, jedoch bis dato bei vielen Anwender:innen weniger sich stark im Focus befindenden Problem. In den letzten Jahren erlebt dieses Thema allerdings aufgrund der zunehmenden Wichtigkeit von Biomolekülen eine gewisse Renaissance.
Um welche Metallionen handelt es sich?
Wo kommen sie her und was bewirken sie?
Sind sie vermeidbar? Und: Können sie entfernt werden?
Doch bevor wir uns dem Thema widmen, zunächst ein kleiner semantischer Exkurs:

Konfusion von Begrifflichkeiten

Begriffe im hiesigen Zusammenhang werden nicht von allen Beteiligten einheitlich verwendet. Dadurch entsteht eine gewisse Konfusion. Nachfolgend eine kurze Einordnung, wobei diese weder den Anspruch auf Vollständigkeit erhebt, noch kann ich erwarten, dass alle mit dieser 100 % d’accord gehen.

  • Bioinert; geringe Wechselwirkungen mit Hardware-Komponenten, geringes Risiko für carryover; ältester Begriff, bereits 1933 verwendet: Aluminium-Oberfläche als Alternative zu Eisen. Im Umfeld der HPLC sind die verwendeten Materialien hier Titan, Keramik, PEEK
  • Biokompatibel; keine Korrosionsgefahr trotz Chlorid-Ionen im Eluenten; oft synonym bzw. gleich zu setzen mit Bio-LC und Stainless steel-free; verwendete Materialien: Titan und spezielle Legierungen, z. B. MP35N
  • Metall-frei; verwendete Materialien: PEEK, Saphir

Weitere anzutreffende Attribute sind: „Inert“, „truly bioinert“ (PEEK), schließlich „fully biocampatible“.

Treffsichere Bezeichnungen wären eher: „Low Adsorption Materials“ bzw. „Corrosion Resistant Materials“ – aber das ist eine persönliche Ansicht.

  1. Wo kommen sie her?
  • Bei älteren stationären Phasen befinden sich Schwermetallionen als Kontaminationen in der Kieselgel-Matrix. Das verwendete Kieselgel der ersten Generation ist natürlichen Ursprungs und unterliegt demnach natürlichen Schwankungen. Somit befinden sich Schwermetallionen, aber auch K, Na, Ca, Al etc. im Kieselgel-Gerüst, siehe Abbildung 1

Abbildung 1
Metallionen im Kieselgel für die HPLC

  • Alle in der HPLC verwendeten Lösungsmittel waschen Metallionen aus metallisch-verbauten Teilen in der Anlage aus, siehe Abbildung 2-4

 

Abbildung 2-4
Metallionen, die von HPLC-Lösungsmitteln herausgewaschen werden

– Acetonitril hat die geringste „Auswaschkraft“
– Auch das harmlos anmutende Wasser wäscht „ordentlich“ Metallionen
aus
– Die Legierung MP35N enthält zwar keine Eisenionen, aber die anderen
darin erhaltenen Metallionen werden von allen Lösungsmitteln
herausgewaschen – speziell von Wasser, siehe in Abbildung 4 die ausgewaschene
Menge an Metallionen! Kann man bei Verwendung eines derartigen Materials in
einer HPLC-Anlage von „Bio-LC“ sprechen? (Bio)Moleküle können ja auch mit
anderen Metallionen außer Eisen komplexieren!

  • Metallionen kommen zusammen mit der Probe in das Gerät und gelangen damit zur Säule, wo sie in/an der stationären Phase adsorbiert werden. Man denke nur an Kontrastmittel (Barium, Gadolinium) und Zytostatika (Platin-Ionen)
  1. Was bewirken sie? Nachfolgend einige Beispiele:
  • Metallionen an der Kieselgel-Oberfläche können zum einen Metall-Komplexe bilden, siehe Abbildung 1 und 5. Sich im Inneren der Kieselgel-Matrix befindenden Schwermetallionen üben zum anderen einen -I-Effekt auf die Silanolgruppen aus (sie ziehen von ihnen Elektronen ab) und begünstigen dadurch die Bildung von dissoziiert (ionisch) vorliegenden und somit „aggressiven“ Silanolen. Solche können mit basischen Molekülen Ionenaustausch-Wechselwirkungen eingehen, Ergebnis: Chemisches Tailing. Wir haben weiter oben gesehen, dass die älteren Kieselgele eine beträchtliche Menge an Metallionen als Kontaminationen enthalten. Das ist der Grund, warum bei älteren Säulen trotz Verwendung eines sauren Eluenten immer wieder chemisches Tailing auftaucht – es klappt bei solchen Materialien kaum, „aggressive“ Silanole zu vermeiden

Abbildung 5
Einfluss von Metallionen in der Kieselgelmatrix

  • Biomoleküle, aber auch andere Moleküle (Lewis Basen, Säuren) werden teilweise an Metalloberflächen adsorbiert, Ergebnis: Keine reproduzierbaren Peakflächen, starkes Tailing, in Worst Case totale Adsorption (Memory-Effekt, carryover)
  • Fe2+-Ionen können Komplexe bilden (Carboxylate, N-haltige Substanzen mit einem freien Elektronenpaar am Stickstoff), ferner wirken sie katalytisch bei einer Reihe von Reaktionen
  • Durch Fe2+-Ionen können Chinone zu Katecholaminen reduziert werden
  • Es besteht generell die Gefahr, dass in einer HPLC-Anlage – vor allem bei einer häufigen Verwendung von Puffern – ein Biofilm entsteht. Aus Bakterien entstehen Zuckerverbindungen, die wiederum eine Polymermatrix bilden. Diese „saugt“ (auch) Schwermetall- und Alkalionen auf; durch die Biomineralisation entsteht eine harte Plaque, die schwer zu entfernen ist. Ergebnis: Tailing und/oder „Buckel“
  1. Sind sie zu vermeiden?
    Wohl kaum: So lange Lösungsmittel mit metallischen Oberflächen – welche auch immer – in Berührung kommen, werden Metallionen in bestimmter Konzentration ausgewaschen. Es kommt auf die Moleküle an, inwieweit dieser Vorgang schlimm ist. In der Zwischenzeit gibt es schon mit einer PEEK-Ummantelung versehene Säulen (Druckstabilität?) bzw. beschichtete Säulen, z. B. amorphes Glas. Die Moleküle „sehen“ in der Säule demnach keine Metall-Oberfläche – aber eben, nur in der Säule. Und merke in diesem Zusammenhang: Je größer die (spezifische) Oberfläche ist, umso mehr Metallionen werden aus dieser ausgewaschen, so verdient beispielsweise die Fritte besondere Beachtung. Es sind zwar seit einiger Zeit Bestrebungen im Gange, aber bis dato gibt es (noch) keine kommerziell erhältlichen, vollständig metallfreien HPLC-Anlagen.
  2. Können sie (vollständig) entfernt werden?
    Auch hier lautet die Antwort: Wohl kaum. Natürlich sind Spülprozeduren mit EDTA und Phosphor-/Oxalsäure usw. bekannt und beschrieben worden. Abgesehen von praktischen Problemen, ist ein derartiger Schritt zwar hilfreich, aber er kann nie zu einer vollständigen und vor allem nachhaltigen Entfernung von Metallionen führen. Kann man Metallionen in der Apparatur denn nicht wenigstens „verstecken“? Ja schon, auch das ist möglich, aber dies stellt schwerlich eine zufriedenstellende Lösung auf Dauer dar: Passivieren mit 6 N HNO3 hilft definitiv eine Zeit lang – aber eben: Eine Zeit lang. Die Prozedur ist etwas aufwendig und müsste 2–3-mal im Jahr wiederholt werden. Also, passivieren: Vielleicht, hilfsweise, u.U., evtl. und als „Ultima Ratio“ schon überlegenswert. Die Entfernung eines möglichen Biofilms ist eine Sache für sich, damit werden wir uns in einem zukünftigen HPLC-Tipp befassen.

Wir haben die ganze Zeit auf die „armen“ Metallionen eingedroschen. Gibt es denn nichts Positives über sie zu sagen? Doch schon: Man kann bestimmte chirale Säulen bewusst mit Cu2+– oder Cd2+-Ionen belegen. Diese Kationen bilden mit den chiralen Selektoren auf der Oberfläche des Materials und den zu trennenden Enantiomeren große Komplexe. Acetonitril-Moleküle bedingen eine Chelatstabilisierung, es ergibt sich eine hervorragende Enantioselektivität („Ligandenaustausch-Chromatographie“). Aber ich muss zugeben, das hier ist schon etwas Spezielles…

© Dr. Stavros Kromidas

Weitere Tipps von diesem Jahr finden sich unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

 

sk
9. Oktober 2024
AllgemeinBodenzahlSystemeignungstest (SST)Variationskoeffizient (Vk)

Kriterien bei Systemeignungstests (SST) in der HPLC

Der Fall

Pragmatismus hilft oft – auch in der HPLC: Wenn alle Beteiligte (Anwender:innen, Labormanagement, Kunde, Auditor/Inspektor) mit den vorgegebenen Kriterien resp. SST-Anforderungen (SST: System Suitability Tests, Systemeignungstests) zufrieden sind, besteht kein dringender Handlungsbedarf. Wenn allerdings häufig OOS-Situationen auftreten oder das Aufwand/Nutzen-Verhältnis aus praktischer Sicht nicht wirklich überzeugend erscheint, sollten – sofern es realistisch Sinn macht – die aktuellen Kriterien hinterfragt werden. Welche SST-Kriterien sind sinnvoll?

Die Lösung

Halten wir vereinfacht wie folgt fest: Bei einem SST geht es darum zu überprüfen, ob diese Methode „hier und jetzt“ an diesem Gerät nach vorgegebenen Kriterien funktioniert.
Bemerkung: Die Frage, ob für einen SST eine Standard-Lösung oder eine „reale“ Probelösung – also eine Lösung, die bzgl. Konstitution, Konzentration, Matrix etc. den Proben entspricht, die gleich vermessen werden – verwendet werden soll, lassen wir hier außen vor.
Nun, die HPLC ist eine Trenntechnik; die zwei Hauptziele sind i.d.R.:
1. Genügend gute Trennung inkl. Identifizierung und damit zusammenhängend eine gesicherte qualitative Information: „Ich sehe alle mich interessierende Analyten/Peaks“
2. Gesicherte quantitative Information: „Wie reproduzierbar ist die Integration und demnach die Ermittlung der Peakfläche der mich interessierenden Peaks?“ Und: „Ist der Wert überhaupt richtig?“

In den meisten Fällen liegt der Focus auf beides: „Ich will alle (interessierende) Peaks so gut trennen können, dass ich sie „richtig“ und reproduzierbar integrieren kann“.

Zu 1: „Gute“ Trennung

Ein Maß – vermutlich das beste – für die Güte einer Trennung in der Chromatographie ist die Auflösung, das ist der Abstand zwischen zwei Peaks an der Peakbasis. Am Ende einer Methodenentwicklung und bevor betreffende Methode in die Routine geht, wird von einer Entscheidungsperson (Labormanagement, Kunde usw.) oder einer übergeordneten Organisation definiert, welche Auflösung für die konkrete Fragestellung erreicht werden soll, z. B: „Die Auflösung zwischen dem kritischen Peakpaar 4 und 5 soll ≥ 1,5 sein“. Wir unterstellen hier, dass vorgegebene Anforderung im konkreten Fall ihre Berechtigung hat. Wenn es um die Trennung von mehreren Peaks geht – was oft bei Gradiententrennungen der Fall ist – stünde die Peakkapazität im Vordergrund: Anzahl der Peaks pro Zeiteinheit. Wenn nun beim SST jene Anforderung (Auflösung bzw. Peakkapazität) erfüllt wird, ist alles OK, das Testen ist beendet. Mehr Messungen/Kriterien braucht man nicht.

Begründung:
In der Auflösung steckt die Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Retentionsfaktor k), die Selektivität (Unterscheidungsfähigkeit des chromatographischen Systems für zwei Substanzen, Trennfaktor Alpha) und die Effizienz (wie schmal/symmetrisch ist ein Peak, das ist die Trennleistung, angegeben als Bodenzahl N). So wären weitere (zusätzliche) SST-Kriterien wie z. B. „Retentionszeit 12 min +/- 2 min“ oder „Bodenzahl nicht unter 2.000 Böden“ oder „Tailingfaktor nicht größer als 1,3“ zwar keinesfalls falsch, dennoch überflüssig, denn: Es kann nicht passieren, dass beispielsweise die Trennleistung meiner Säule so furchtbar nachgelassen hat oder die Selektivität meines chromatographischen Systems dermaßen stark abgenommen hat, ohne dass ich es mitbekomme. Denn geschähe es, würde auch die Auflösung unter die hier definierte Grenze von 1,5 fallen. Und aus pragmatischer Sicht ist es völlig irrelevant, ob meine Säule aktuell 2.000 Böden oder eben nur noch 1.900 Böden aufweist. Und wenn vielleicht auch ein paar C8-Alkylketten durch Hydrolyse abgespalten worden sind – „so what?“ Die stationäre Phase kann offensichtlich weiterhin genügend gut die zwei betreffenden Moleküle nach meinen Kriterien unterscheiden – ich erreiche doch die geforderte Auflösung von 1,5! Und das ist ja was ja zählt.
Eine etwas überzogene Analogie: Angenommen, ich habe als ausschließliches Ziel definiert, nicht mehr als 80 kg auf die Waage zu bringen. Und: Ich erreiche es. Nun, das, was zählt, ist das Ergebnis. Die Beschäftigung mit der Frage, ob ich gestern lieber 3 statt 4 Kartoffeln hätte essen sollen, bedeutet Zeit- und Gedankenverschwendung. Solche Nebensächlichkeiten versperren mir den Blick für wichtigere Sachen.

Zu 2: Gesicherte quantitative Information: Das Ergebnis soll richtig und präzise sein

Diese Forderung ist bei sehr kleinen Peaks, das wären also welche in der Nähe der Bestimmungsgrenze (LOQ) sowie bei nicht gut aufgelösten und/oder tailenden Peaks, besonders kritisch. Welches SST-Kriterium kann hier hilfreich sein? Das könnte einerseits der Variationskoeffizient der Peakfläche sein, der sich bei einer beispielsweise 5- oder 6-fachen Injektion ergibt. Somit weiß ich, dass mein Rechner mit dieser Software und diesem Integrationsalgorithmus bei diesen Settings (Sample Rate, Spalt, Bandwitdth etc.) diese(n) Peak(s) reproduzierbar integrieren kann. Auch hier wäre die Anforderung, einen bestimmten Tailingfaktor nicht zu überschreiten oder ein bestimmtes Signal-to-Noise-Verhältnis S/N zu erreichen, unnötig, denn: Offensichtlich kann das Auswertesystem Peak Anfang und -Ende trotz einem womöglich vorhandenen Tailing und/oder erhöhtem Rauschen reproduzierbar finden, es wird ja reproduzierbar (präzise) integriert: Die somit ermittelte Peakfläche gibt mir die Information bzgl. Präzision. Dies gilt analog auch für nicht-basisliniengetrennte Peaks. Die Richtigkeit andererseits kann durch die Injektion einer geeigneten Referenzlösung belegt werden. Hier sollte(n) der/die betreffende(n) Peak(s) in der Probe- und in der Referenzlösung bzgl. Peakform und Größe identisch sein. Ansonsten besteht die Gefahr eines systematischen Fehlers durch unterschiedliche Integration und folglich falsch ermittelte Peakfläche. Durch diese zwei Messungen erhalte ich eine gesicherte quantitative Information bzgl. Genauigkeit der HPLC-Analyse (Genauigkeit: Richtigkeit plus Präzision).

Zusammengefasst:
Lautet die Anforderung an eine HPLC-Methode, „Kann ich X von Y sicher abtrennen und ist das Ergebnis richtig und präzise (qualitative und quantitative Info)?“ Wenn ja, dann eignen sich als SST-Kriterien die Auflösung des besagten Peakpaares und der Variationskoeffizient einer realen Probe bei der geforderten Konzentration. Die Richtigkeit kann mit Hilfe einer Referenzlösung belegt werden. Übrigens erweist sich folgende Praxis als recht hilfreich: Das Auftragen relevanter Zahlen wie z. B. Auflösung und Variationskoeffizient in eine Qualitätsregelkarte (SPC, Statistische Prozesskontrolle) ist ein hervorragendes Monitoring-Tool für die Historie der Methode. Und: Die derartige Visualisierung einer ISK-Situation (ISK: In Statistischer Kontrolle = Enge Verteilung der Werte um einen Mittelwert, also innerhalb des Vertrauensbereichs) überzeugt oder stimmt wenigstens positiv jeden Vorgesetzten/Kunden/Inspektor/Auditor.

Das Fazit

Es kommt in der HPLC auf die Auswahl von praxisnahen, Fall-spezifischen, gut durchdachten SST-Kriterien. Gelingt es, eine solche Auswahl zu treffen und wird die Anforderung im Folgenden erfüllt, weiß ich, dass alles OK ist. Die Angst, zu wenig zu machen oder etwas Wichtiges vergessen zu haben sollte dann nicht mehr existieren. Immer knapper werdende Rohstoffe wie Zeit, Energie und Chemikalien werden geschont, unnötige Gedanken, Wiederholmessungen und Diskussionen, die keinen echten Mehrwert bedeuten, vermieden. Und das ist gut so.

© Dr. Stavros Kromidas

Weitere Tipps von diesem Jahr finden sich unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

sk
20. August 2024
A FehlersucheB OptimierungDoppelpeaksEluentGeisterpeaks & negative PeaksInjektionsvolumenkleine PeaksLebensdauer der SäuleLösungsmittelPeaks vor - oder nahe - der TotzeitPeakverbreiterungpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)polare KomponentenProbenlösungsmittelRobustheit

Die kleinen HPLC-Tipps im Sommer: Die 80 % Regel, Vorteile Methanol, Probelösung und Eluent

Im – jedenfalls kalendarischen …– Sommer wollen wir uns mit kleinen, knackigen Tipps beschäftigen. Heuer geht es um „die 80 %-Regel“, „Vorteile von Methanol“ und „Mach´ Probelösung und Eluent möglichst ähnlich“.

„80%-Regel“

Bei einer Routine-Methode steht i.d.R. Robustheit an erster Stelle, das heißt beispielsweise: Ich erwarte reproduzierbare Ergebnisse und die Säule soll möglichst lange halten. Es hat sich gezeigt, dass ein „Puffer“, also ein Abstand, von ca. 20 % von einem Grenzwert Sicherheit liefert. Nachfolgend einige Beispiele:

  • Einige GPC/SEC-Säulen sind laut Datenblatt bis 100 bar stabil; das Nicht-Überschreiten von 80 bar im Dauerbetrieb beschert eine lange Lebensdauer
  • Manch ‘ein Säulenofen ist von 5 – 80 °C spezifiziert; an beiden Grenzen – also ca. 6 °C sowie ca. 70 °C – ist eine richtige und präzise Temperatur-Einstellung nicht immer gewährleistet. Messungen in diesen Bereichen sind oft nicht reproduzierbar
  • Bei einer Reihe von Säulen wird als pH-Wert-Verträglichkeit der Bereich 2 – 8 angegeben; im Dauerbetrieb würde ich allerdings bei derart spezifizierten stationären Phasen nicht unter ca. pH von 2,4 und nicht über ca. pH 6,5 gehen: Im Sauren können kleine funktionelle Gruppen hydrolysiert werden („Bluten“ der Säule) und ab ca. pH 7,0 kann sich das Kieselgel auflösen. Denke in diesem Zusammenhang auch an eine Verschiebung des pH-Wertes nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels
  • Ein Dauerbetrieb von nicht über ca. 80 % vom „High Pressure Limit“ der Pumpe schont Dichtungen und Bewegteile
  • Die Oberfläche von stark hydrophoben RP-Phasen (dichte Belegung der Oberfläche mit C18-Alkylketten) ist bei geringem Fluss und einer Temperatur um die 25 °C oder niedriger und bei mehr als 80 % Wasser/Puffer womöglich nicht benetzt. Man kann zwar problemlos die Säule mit z. B. 80 % Wasser spülen – aber messen? Konstante Retentionszeiten sind zwar möglich, aber na ja…

Schlussbemerkung: Ein „Puffer“ von 10 % ist oft ausreichend, aber wenn die Stabilität in der Routine im Vordergrund steht, wäre ich hier doch etwas vorsichtig.

Vorteile von Methanol gegenüber Acetonitril
Vorbemerkung: Der Focus liegt hier in seiner Rolle bzgl. der chromatographischen Trennung. Andere, unter Umständen sicherlich auch wichtige Aspekte, wie Preis und einfache(re) Herstellung und somit i.d.R. geringere Kontaminationen lassen wir hier außer Acht. Die drei wichtigsten Vorteile gegenüber Acetonitril sind:

  • Die Peakform von Säuren ist besser
  • Ähnliche und/oder polare Komponenten werden besser getrennt
  • Die Unterschiede der stationären Phasen kommen eher zum Vorschein. Mit Acetonitril – vor allem im Zusammenhang mit Puffern – haben wir oft eine Art „Gleichmacherei“: Chromatogramme an unterschiedlichen Säulen sehen mit Acetonitril als organischem Lösungsmittel oft ähnlich aus

Probelösung und Eluent

Optimale Situation:
Die Probelösung ist mit dem Eluenten/dem Anfangsgradienten „identisch“ – nur etwas „schwächer“; schwächer im RP-Modus heißt, polarer. In einem solchen Fall ergibt sich eine gute Peakform, es sind auch keine Störpeaks in der Nähe der Totzeit festzustellen.
Recht gute Situation:
Probelösung und Eluent/Anfangsgradient sind „ziemlich“ ähnlich, z. B. der Eluent enthält Puffer, die Probelösung ist jedoch lediglich Wasser ohne Salz. Oder das organische Lösungsmittel ist in beiden Fällen identisch, allerdings in unterschiedlicher Konzentration.
Suboptimale Situation:
Probelösung und Eluent/Anfangsgradient sind nicht identisch; je größer die Unterschiede, umso größer die Probleme. Als Probleme sind zu nennen: Fronting/Doppelpeaks, evtl. Abnahme der Retentionszeit (Probelösung ist stärker im Vergleich zum Eluenten/Anfangsgradienten), Geisterpeaks/negative Peaks in der Nähe der Totzeit, evtl. Peakverbreiterung/Tailing (unterschiedlicher pH-Wert, Salz ja/nein, Modifier ja/nein usw.)

Empfehlung: Wenn Probelösung und Eluent nicht identisch sein können: Versuchen Sie wenigstens sie ähnlich zu machen: z. B. Probelösung 1:1 oder 1:2 mit dem Eluenten verdünnen und das doppelte/dreifache Volumen injizieren: Die Peakform wird besser.

© Dr. Stavros Kromidas

 

sk
2. Juli 2024
AllgemeinC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseSäuleSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Wie lang soll ich eine HPLC-Säule equilibrieren?

Der Fall
Vorbemerkung: Die Rede ist hier von RP-Phasen und von kleinen Molekülen, Biomoleküle ist eine ganz andere „Story“ ebenso wie Ionenaustauscher und HILIC …
Als Faustregel gilt: 10-15 Säulenvolumina sollten reichen.

Das Säulenvolumen kann in erster Näherung mit folgender empirischer Formel berechnet werden:

Vs = tM x F/0,8 mit:
Vs: Säulenvolumen in ml
tM: Totzeit in min
F:  Fluss in ml/min

Für eine 125 x 4 mm Säule beispielsweise (Fluss 1 ml/ min, Totzeit 1 min, Säulenvolumen ca. 1,25 ml), würden somit ca. 15-20 ml ausreichen.

Nun, wie „gut“ ist diese Faustregel?

Die Lösung

Weiter oben vorgestellte Faustregel ist gut anwendbar für MeOH/Wasser- und ACN/Wasser-Eluenten ohne Zusätze. Ferner für eher saubere Proben, also keine Umwelt- oder biologische Proben bzw. stark kontaminierten Proben.

Jetzt kommen wir zu den „schwierigeren“ Fällen, also zu Fällen, bei denen diese Faustregel ungenügend ist: Das notwendige Volumen zum Equilibrieren ist hier größer:

  • Ältere Säulen, d.h. welche auf Basis von Kieselgel der ersten Generation (z. B. LiChrospher, Spherisorb, Bondapak, Supelcosil) sowie generell polare RP-Säulen wie Phenyl, Cyano oder Pentafluorphenyl, ferner Mixed-Mode-Phasen
  • Stationäre Phasen mit größer spezifischer Oberfläche, z. B. 350 oder 400 m2/g. Solche haben i.d.R. kleine Porendurchmesser. Anders formuliert: Eine stationäre Phase mit 60 oder 80 Å-Poren benötigt eine längere Equilibrierzeit als eine mit einem Porendurchmesser von beispielsweise 300 Å.
  • Der Eluent enthält über ca. 90% Wasser/Puffer, dadurch ergibt sich evtl. eine nur teilweise Benetzung der RP-Oberfläche
  • Temperatur unter ca. 25 °C
  • Die mobile Phase enthält über ca. 20 mMol Puffer oder/und Triethylamin oder/und Trifluoressigsäure bzw. Ionenpaarreagenzien, wobei Dodecylsulfonsäure natürlich „schlimmer“ ist als Methansulfonsäure

In solchen Fällen sollte das Volumen für das Equilibrieren ca. 30-50 Säulenvolumina betragen. Für die hier beispielhaft angenommene 125 x 4 mm Säule wären es ca. 40-60 ml. Es versteht sich von selbst, dass ungünstige Kombinationen das notwendige Volumen erhöhen, z. B: Eine polare stationäre Phase mit einer großen spezifischen Oberfläche betrieben mit einem gepufferten Eluenten bei niedriger Temperatur … Hier oder bei problematischen Matrices (Gewebe, Creme, Pflanzenextrakt, Polymere, Dextrane usw.) sollte das Volumen auf 80-100 ml erhöht werden, z. B. 2 ml/min, 45 min bei 30-35 °C.
Einfacher Test, ob das Equilibrieren erfolgreich gewesen ist: Säule umdrehen und ca. 20-50 µl Equilibrierlösung bei niedriger Wellenlänge injizieren. Sehe ich einen (breiten) Peak bzw. ein „Gebirge“ in der Basislinie? Wenn nicht, ist alles in Ordnung.

Das Fazit

Die notwendige Equilibrierzeit ist abhängig von den chromatographischen Bedingungen, der Natur der stationären Phase sowie der Matrix. Die weiter oben angegebenen Faustregeln haben sich als brauchbar erwiesen.

© Dr. Stavros Kromidas

 

sk
16. Mai 2024
AllgemeinAuflösungB OptimierungChromatogrammOptimierung

Möglichst maximale Peakkapazität in der HPLC gewünscht? Mach´s lang, dünn, warm, evtl. auch langsam

Der Fall
Nehmen wir an, Sie haben recht viele, recht ähnliche Komponenten zu trennen. In einem solchen Fall ist eine ausreichende Selektivität – also unterschiedlich starke Wechselwirkungen der einzelnen Komponenten mit der stationären Phase – realistischerweise kaum erreichbar. Der einzige Ausweg lautet: Eine möglichst gute Peakkapazität, also maximal mögliche Anzahl Peaks pro Zeiteinheit. Wie ist dies zu erzielen?

Die Lösung

Es gibt mehrere Formeln für die Peakkapazität, die zwei einfachsten sind folgende:

nC = tRl – tRf / w   und  

nC = tG / w

mit:

nC: Peakkapazität
tRl: Retentionszeit des letzten Peaks
tRf: Retentionszeit des ersten Peaks
tG: Gradientendauer
w: Peakbreite

Was heißt das nun?
Vereinfacht folgendes: Ich brauche eine große Differenz zwischen der Retentionszeit des letzten und des ersten Peaks und die Peakbreite soll möglichst klein sein.
Diese allgemeine Forderung ist „zeitlos“, gilt für alle Gradientenarten und ist auch unabhängig davon, ob es sich um kleine oder große (Bio)Moleküle handelt. D. h. sie ist anwendbar sowohl imfalle von RP-Trennungen als auch beispielsweise bei Ionenaustauschertrennungen von Oligonucleotiden mittels Salz- bzw. pH-Wert-Gradienten.
Was braucht man also?
* Einen langen Gradienten und einen hohen Fluss (großes Gradientenvolumen)
* Eine lange, möglichst dünne Säule (große Retentionszeitdifferenz letzter/ertster
Peak, maximal erreichbare Auflösung aufgrund des geringen
Säuleninnendurchmessers der Säule)
* Kleine Teilchen sind nur bei wirklich sehr schwierigen Trennungen notwendig (schmale Peaks)
* Imfalle von „unproblematischer“ Matrix: Kein poröses, sondern Core Shell-Material (schmale Peaks)
* Höhere Temperaturen (schmale Peaks)
* Einen hohen Start- und einen hohen End % B (schmale Peaks)
* Bei großen Molekülen, tendenziell kleine Flussraten: Aufgrund der Molekülgröße ist
deren Kinetik bei der Desorption von der Oberfläche der stationären Phase langsam
(großer C-Term der Van-Deemter-Gleichung); der kleine Fluss führt zu einer
guten Effizienz (große Bodenzahl) und somit zu schmalen Peaks und folglich zu einer kleinen Peakbreite

Nachfolgend vereinfachte Empfehlungen, die sich aus eigenen, zahlreichen Experimenten zur Gradientenoptimierung mit Focus Peakkapazität herauskristalisiert haben:
– Start mit 30-40 % B; streben Sie ferner eine Mindestdifferenz zwischen Anfangs- und
End % B von ca. 40 %, eher von ca. 60 % B
– Fluss bei posösen Teilchen 2 ml/min, bei Core Shell 1-1,5 ml/min, bei großen
Molekülen 0,8-1 ml/min; bei sehr langsamer Kinetik durchaus 0,15-0,35 ml/min
– Kleine Teilchen (1,7-1,9 µm) sind nur bei sehr anspruchsvollen Trennungen
vonnöten, nur in solchen Fällen spielen im Gradientenmodus die kleinen Teilchen ihre
Vorteile aus – aber dann schon „ordentlich“!
– Benötigtes Gradientenvolumen (beispielhaft):
* 30 ml (z. B. 2 ml/min, Gradientendauer 15 min) für ca. 30-40 Peaks
* 40 ml für ca. 40-50 Peaks
– Säulendimesionen (beispielhaft):
* 150 mm x 2,1 mm für ca. 50-60 Peaks
* 250 mm x 2,1 mm für ca. 60-80 Peaks

Das sind relativ einfach zu erzielbare Ergebnisse; natürlich sind noch „bessere“ Ergebnisse möglich, wenn weitere Möglichkeiten der Optimierung zunutze gemacht werden, hier zwei Beispiele:
– 300 x 2,1 mm-Säule im UHPLC-Modus und/oder Verwendung von Core-Shell-
Material
– Konkaves Gradientenprofil

Sind mehr als 100 Peaks zu trennen, ist die serielle Kopplung von langen, dünnen Säulen die beste Möglichkeit (sofern man bei 1-dimensionalen Trennungen bleiben möchte), die maximal-mögliche Peakkapazität zu erreichen. In Abb. 1 werden zwei 600 mm x 2,1 mm-Säulen gezeigt, die für solche Trennungen benutzt wurden.

Zum Schluss zwei Beispiele, die das weiter oben aufgeführte untermauern:
In Abb. 2 wird einer Trennung aus den 1980er Jahren aus einem Bayer-Labor in Dormagen gezeigt: Bei einem Gradientenvolumen von ca. 36 ml sind an einer 200 x 3 mm ca. 60 Peaks von großen Molekülen (Ethylenglykolpolyadipat) zu trennen.

In Abb. 3 wird ein Beispiel von ThermoScientific gezeigt: Bei einem Gradientenvolumen von ca. 13 ml und Verwendung eines konkaven Gradienten sind an einer 250 x 4 mm-Säule in ca. 14 min 56 Nucleotide und 12 Varianten zu trennen.

Das Fazit
Für eine gute Peakkapazität wird eine lange, möglichst dünne Säule und – sofern die Molekülstabilität es erlaubt – eine höhere Temperatur benötigt. Das notwendige Gradientenvolumen hängt von der Anzahl der zu erwarteten Peaks ab. Dieses ist über die Gradientendauer oder – bei kleinen Molekülen und keiner zu langsamen Kinetik oft sinnvoller – über den Fluss einzustellen. Ein tendenziell hoher % B zu Beginn, d. h. direkt eine erhöhte Elutionskraft, „schiebt“ die Peaks nach vorne und die dadurch resultierende schmale Peakform begünstigt eine gute Peakkapazität. Kleine Teilchen sind schließlich nur dann zu empfehlen, wenn die Herausforderung groß ist und der resultierende Druck keine große apparative Probleme bereitet. Eine moderne Anlage mit einem möglichst kleinen Dispersionsvolumen ist zweifelsohne von Vorteil.
Zusammengefasst sollte für eine zu erwartete Zahl von 50 und mehr sehr ähnliche Komponenten folgendes angestrebt werden:
Säulenlänge: 150-250 mm
Säuleninnendurchmesser: 2,1–3 mm
Teilchengröße: 1,7-1,9 µm poröses bzw. 2,5-2,7 µm Core Shell Material
Temperatur: 70-90 °C (Probestabilität?!)
Fluss: Bei großen Molekülen und/oder dualem Mechanismus (langsame Kinetik) nicht höher als 1 ml/min, mitunter 0,3-0,4 oder sogar 0,15-0,20 ml/min

 

 

sk
4. April 2024