Eine Methode läuft an zwei identischen HPLC-Anlagen. Eine der zwei Anlagen erzeugt problematische Chromatogramme, z. B. Drift der Basislinie, „Buckel“ oder Geisterpeaks. Woran kann es liegen?
Die Lösung
Bemerkung:
Die hier besprochenen Probleme machen sich insbesondere bei niedrigen Wellenlängen und bei hochauflösenden Massenspektrometern bemerkbar.
Eine mögliche Erklärung wäre folgende: An der Anlage, die keine Probleme bereitet, wird Lösungsmittel aufgefüllt, sobald das Reservoir ca. zur Hälfte geleert ist. An der „problematischen“ Anlage wird gewartet bis das Lösungsmittelreservoir fast leer ist, um es wieder aufzufüllen, Ergebnis: Das letztgenannte Handling kann zu unterschiedlicher Konzentration an Störsubstanzen führen. Es ergeben sich womöglich folgende Probleme:
Acetonitril-Reservoir
Aus Acetonitril kann mit der Zeit Aceton entstehen – und Aceton ist UV-aktiv. Bei geringer Acetonitril-Menge ist die Konzentration an Aceton im Raum über der Acetonitril-Oberfläche hoch, Ergebnis: Leichte Drift, die immer stärker wird
Unter Lichteinwirkung können in Acetonitril Polymere entstehen. Bei geringer Acetonitril-Menge im Lösungsmittelreservoir ist deren Konzentration hoch, die Konsequenz lautet: „Buckelige“ Basislinie. Ihre Konzentration bei einem halbvollen Lösungsmittelreservoir dagegen ist gering, das Problem ist nicht existent oder marginal
Ähnlich verhält es sich bei geringer Acetonitril-Menge und vorhandenen polaren Verunreinigungen dort wie Nitrile (insbesondere Imine), Acrylnitril, Ammoniak, Essigsäure. In diesem Fall tauchen Geisterpeaks auf. In minderwertigen HPLC Acetonitril-Chargen sind mehr Verunreinigungen denkbar, nachfolgend ein Überblick:
Wasser-/Puffer-Reservoir
Analog weiter oben: Wenn eher lang gewartet wird, um das Reservoir mit der wässrigen Phase wieder aufzufüllen und dies im Zusammenspiel mit erhöhter Temperatur und direktem Lichteinfall auf letzteres können Mikroorganismen wachsen. Diese bewirken verstärkt „Buckel“ in der Basislinie, Doppelpeaks bzw. Peak-Schulter/Tailing und Druckschwankungen. Im unangenehmsten Fall kann sich der pH-Wert durch Stoffwechselprodukte erniedrigen. Neben den Folgen für die Trennung bei einem veränderten pH-Wert (insbesondere in der Nähe vom pKS-Wert des Analyten!) kann sich das Auswaschen von Metallionen aus allerlei metallischen Oberflächen verstärken. Metallionen können mit bestimmten Analyten komplexieren, was zu einer Verschlechterung der Peakform und/oder zum Memory-Effekt führen kann.
Das Fazit
Eigentlich recht einfach: Warten Sie mit dem Auffüllen des Lösungsmittelreservoirs nicht zu lange! Noch besser im Falle von Gradientenläufen: Vormischen von A und B. Wasser im Acetonitril-Reservoir verhindert die Bildung von Polymeren, Acetonitril im Wasser-Reservoir das Wachstum von Mikroorganismen. Dass sich darüber hinaus noch eine ruhigere Basislinie und eine bessere Reproduzierbarkeit der Retentionszeit ergeben, sind willkommene Nebeneffekte.
Die Injektionsreproduzierbarkeit bei kleinen Injektionsvolumina um die 1-2 µl (oder noch kleiner) stellt bei modernen Geräten heute zunächst keine besondere apparative Herausforderung dar. Falls dennoch in einem aktuellen Fall die Injektionsreproduzierbarkeit zu wünschen übriglässt: Wie sollte verfahren werden?
Die Lösung
Vorbemerkung: Es versteht sich von selbst, dass für die nachfolgend beschriebene Tests reale Proben injiziert werden sollten; Injektionen von Standardlösungen zeitigen lediglich die Reproduzierbarkeit des Autosamplers für betreffendes Injektionsvolumen. Nicht jedoch, ob „hier und jetzt“ diese Methode an diesem Gerät gemäß den Anforderungen funktioniert. Injektionen von Standardlösungen sind nur dann statthaft, wenn im Rahmen der Validierung belegt worden ist, dass die Probematrix das Ergebnis nicht (signifikant) beeinflusst.
Als erstes würde ich das Injektionsvolumen wie in der Methode angegeben sowie das 2-, 3-, 4-fache davon injizieren. Wird die Peakfläche um das 2-, 3-, 4-fache erhöht? Wenn ja wissen Sie, dass in diesem niedrigen Konzentrationsbereich die Linearität gegeben ist. Als nächstes käme ein weiterer, etwas aufwendiger Test, die Notwendigkeit kann nur individuell bejaht werden: Jedes der vier Injektionsvolumina wird 5-mal injiziert und der Variationskoeffizient ermittelt. Der jeweils sich ergebende Variationskoeffizient zeigt Ihnen „schwarz auf weiß“, welche Präzision für welches Injektionsvolumen bei dieser Probe und diesen chromatographischen Bedingungen zu erwarten ist. Diese Kenntnis hilft zu beurteilen, ob die Anforderung an die Methode realitätsnah ist. Dieser Test soll keinesfalls die Prüfung auf Linearität ersetzen, vielmehr geht es hier darum zu überprüfen, ob die Signale (Peakflächen) der betreffenden Konzentrationen sich auf der Kalibriergeraden im unteren Bereich befinden. Etwas genauer: Ob die jeweiligen Mittelwerte aus den 5 Injektionen noch im Vertrauensbereich der Kalibriergeraden befinden, also oberhalb der Bestimmungsgrenze und somit im quantitativ „sicheren“ Bereich.
Nachfolgend werden einige Gründe genannt für den Fall, dass Test 1 und/oder Test 2 nach Ihren Kriterien nicht zufriedenstellend abgelaufen ist/sind:
Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit ist zu groß für die Viskosität der Probelösung
Durch Physisoption/Adhäsion an der Injektionsnadel geht ein Teil der Probe verloren. Merke in diesem Zusammenhang: Je verdünnter und je polarer die Probelösung ist und je geringer die Probekonzentration, umso größer ist generell die Gefahr für Sorption an allerlei „hungrigen“ Oberflächen
Falls Einsätze („inserts“) in den Vials verwendet werden: Bei starker Verjüngung kann dort eine Luftblase entstehen, die bei repetitiven Injektionen zu mangelnder Reproduzierbarkeit führt. Das Aufkommen der Nadel auf den Boden des Vials/Inserts gehört grob in diese Kategorie von Fehlerquellen
Wenn das Problem – also die Abweichung der Peakfläche vom erwarteten Wert oder die Streuung der Werte – mit der Zeit größer wird, handelt es sich um eine zeitabhängige Veränderung, nachfolgend drei Beispiele. Bemerkung: Ähnlich der Problematik bei der Physisoption: Es zeigt sich, dass die hier beschriebenen Schwierigkeiten bei stark verdünnten Proben und geringen Injektionsvolumina sich stärker bemerkbar machen im Vergleich zu Injektionen im ppm-Bereich und bei Injektionsvolumina größer ca. 5 µl
Das Probelösungsmittel verdampft und somit ändert sich die Probenkonzentration im Vial
Der pH-Wert der Probelösung ändert sich durch den Einfluss von Silanolgruppen an der Oberfläche vom Vial/insert, dadurch kann sich die UV-Absorption des Analyten ändern
Die Konzentration von evtl. ausgewaschenen Metallionen aus der Injektionsnadel im Vial nimmt bei Wiederholinjektionen zu
Das Fazit
Test 1 hilft, schnell zu erfahren, ob überhaupt zuverlässige Ergebnisse bei der angegeben Konzentration erwartet werden können. Test 2 zeigt Ihnen anhand von Zahlenwerten, welches Injektionsvolumen der aktuellen Probe mit welcher Präzision injiziert werden kann.
Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt. Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss.
Highlight: Mehrdimensionale Trennungen
Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken.
Begründung: Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information in einem einzigen Lauf. Vor diesem Hintergrund erweist sich HPLC-MS/MS oder auch UHPLC-HRMS erwartungsgemäß als völlig ungenügend. “Mehrdimensional“ bezieht sich an der Front der HPLC heute sowohl auf die chromatographische als auch – im Besonderen! – auf die Detektionsseite: In der ersten Dimension gesellt sich zu einer möglichst selektiven Säule immer mehr eine zweite orthogonale (z. B. RP-HILIC, LC-HPSEC) oder aber es wird eine zweite orthogonale Technik, z. B. eine enzymatische Reaktion, gewählt. Das Ziel ist, eine erste, maximal-mögliche Diskriminierung der Substanzen zu erreichen. Für die zweite Dimension eröffnet sich nach der zweiten (kurzen) Säule ein Potpourri an spektroskopischen Techniken. Diese werden miteinander kombiniert, um Ionen weiter zu fragmentieren und somit die Spezifität merklich zu erhöhen was letztendlich zu genauen Strukturinformationen führt. Techniken, die noch vor fünf Jahren auch unter MS-User als eher exotisch galten, geraten heute, ob ihres unbestrittenen Potentials immer stärker in den Focus, nachfolgend werden solche lediglich genannt: Ion mobility spectrometry (IMS), Differential Mobility Spectrometry (DMS), Collision Induced Dissociation (CID), Electron Activated Dissociation (EAD). Obschon eine Kombination beispielsweise von LC-HRMS/MS mit UV PD (Ultra Violet Photo Dissociation) zur Erfassung von organischen Mikro-Schadstoffen ihre Überlegenheit unter Beweis stellt, waren in der Mehrzahl zweifelsohne Vorträge mit der nunmehr fast „klassischen“ LC-ESI-IMS-MS/MS-Kopplung. Da es auch um Zeit geht, lautete ein bezeichnender Hinweis: UHPLC = Sekunden IMS = Millisekunden MS = Mikrosekunden
Was war noch interessant?
IoT (Internet of Things) und Automation, eindeutig ja, Vernetzung von Geräten/Modulen noch eher rudimentär, KI-Einsatz äußerst zögerlich. Kann man in anderen Bereichen fast schon vom „Siegeszug“ der KI sprechen, lässt sich letztere bezüglich analytischen Labors reichlich Zeit … Eine weitere einfache, nicht uninteressante Frage lautete: Warum gibt es im Labor eigentlich kein flächendeckendes Bluetooth?
Das Thema „Unerwünschte Wechselwirkungen der Analyten mit Oberflächen“ wurde intensiv diskutiert. Es gibt bereits mehrere Säulen mit metallfreier Oberfläche, man arbeitet nun an HPLC-Anlagen an denen die Innen-Oberflächen keinerlei Schwermetallen/Schwermetallionen enthalten. Somit gäbe es keine Verschlechterung der Peakform von Komplex-fähigen Analyten und ebenso keine fehlerhaften Peakflächen
Grüne Chemie, hier insbesondere grüne HPLC wurde intensiv diskutiert; es wurde auf einen holistischen Ansatz hingewiesen: Herstellungskosten, Transportkosten, Betriebskosten inkl. Chemikalien und Energie, Zeit zur Datenerhebung, Sinnhaftigkeit der ermittelten Daten, Verarbeitung, Deutung und Verwertung der Informationen, Entsorgung von Chemikalien und Hardware. Aber es wurde auch konkret beispielsweise über Alternativen zu Acetonitril und Methanol gesprochen: Propylencarbonat bzw. Ethanol
Immer mehr Teile werden per 3 D-Druck hergestellt, so z. B. ein kompletter Detektor für unter 2.000,00 €. Die Verfechter dieser Entwicklung, die natürlich nicht aus dem Herstellerumfeld kommen, plädieren für eine Umwelt-freundliche, individuelle und auch gerechtere Analytik: Labore auch in ärmeren Ländern könnten individuelle, maßgeschneiderte, Umwelt-freundliche Lösungen für die Analytik kreieren, so unter anderem einfache, robuste, portable HPLC-Geräte
Ein zeitloses Thema, das seit Jahrzenten in keiner Tagung fehlt, ist nach wie vor „Fundamentals“. Micro- und Nano-LC sowie CE stellen eher kleinere, interessante Segmente dar, ein echter Durchbruch ist im Moment nicht in Sicht
Nachdem in den letzten Tagungen die 2 D-Chromatographie beschrieben und ihre Vorteile einem breiten Publikum bekannt gemacht worden sind, ging es in Düsseldorf um Optimierungsstrategien, um Vorschläge zur effizienten SPAM (Stationary Phase Assisted Modulation), um Details und Tricks aus der Praxis. Ein einziges Beispiel soll das Potential der 2 D-Chromatographie demonstrieren: 160 automatisierte Läufe, Peakkapazität 4.800, 1 Peak/sec
SFC und insbesondere HILIC spielen sowohl bzgl. Zahl der Anwendungsfelder als auch Modellierung von Mechanismen die Rolle, die die RP-HPLC in den 1970er und 1980er Jahre innehatte
Durch die weiter oben erwähnten Möglichkeiten der Spektroskopie erfahren Gebiete wie Umwelt- und Pharmaanalytik, Biologie, Medizin und natürlich Biochromatographie einen enormen Schub. Bei Letzteren stand in vorderer Stelle die Analytik von Glykanen und Oligonukleotiden, Proteine sind und bleiben natürlich ein Dauerthema
Die nächste Veranstaltung in Europa findet im Juni 2025 in Brügge statt.
Sie konnten für bestimmte Probleme (Geisterpeaks, Tailing etc.) das/die vial(s) inkl. Inhaltes als Ursache identifizieren. Und dies obwohl an der Methode eigentlich „nichts“ geändert wurde. An was sollten Sie – auch – denken?
Die Lösung
Probleme können zunächst durch die Injektion selbst hervorgerufen sein. So kann beispielsweise die Injektionsnadel durch ein Septumpartikelchen oder Salzkriställchen teilweise verstopft sein; oder die Nadelspitze ist aufgrund eines harten (dunkelroten) Septums minimal verbogen; oder sind die Purgeflüssigkeit und/oder die Lösung im Waschvial schlicht alt; oder schließlich verhindert Luft in der Spritze/Injektionsnadel das Ansaugen des eingestellten Injektionsvolumens. Hier wollen wir uns jedoch nur auf das/die vial(s) bzw. sein Inhalt als Fehlerquelle konzentrieren. Nachfolgend sind einige Ursachen aufgeführt, die zu einem veränderten Chromatogramm führen können: Veränderung der Peakfläche bzw. Peakform, zusätzliche Peaks, Retentionszeitverschiebungen etc.
Beispiele für Veränderungen der Probelösung
Der pH-Wert Ihrer wässrigen Probelösung hat sich durch Silanolgruppen an der Oberfläche des vials geändert, diese Änderung kann innerhalb einer Stunde über eine pH-Wert-Einheit ausmachen. Es kann sein, dass bei einer langen Sequenz sich eine größere – da zeitabhängige – pH-Wert-Veränderung bei den letzten vials stärker bemerkbar macht; oder Sie haben eine neue Charge von vials eingesetzt deren Oberfläche acidere Silanolgruppen aufweist; oder die Probe bleibt eine längere Zeit im vial, da der Probengeber aufgrund einer kleinen Reparatur eine Stunde lang nicht im Betrieb war
Die Probe bzw. die Matrix ist vielleicht doch ein wenig „anders“ als bei der letzten Messung, z. B. die Produktion/Galenik hat das Herstellungsverfahren/die Formulierung minimal geändert und diese „unwichtige“ Info wird dem Labor nicht übermittelt. Analog auch eine kleine Veränderung des Packmittels: Neue Bestandteile darin diffundieren in die zu analysierende Probe. Eine biologische oder Umweltprobe weist natürliche Schwankungen auf, z. B. war der Sommer eher trocken oder eher nass (Milch, Pflanzensaft, Tabak), erfolgt die Blutentnahme wirklich zur gleichen Uhrzeit, sind die Transportbedingungen konstant geblieben? Eine evtl. veränderte Matrix kann nicht nur zu zusätzlichen Peaks führen, sondern durch eine Änderung des pH-Wertes auch zu Retentionszeitverschiebungen, Änderung der Peakform, im schlimmsten Fall auch zu einer Veränderung der Peakfläche. Beispiel: Eine hochdosierte Tablette hat eine andere Konzentration an Magnesiumkarbonat als die zuletzt gemessenen Proben, was zu einer Veränderung des pH-Wertes der Wirkstofflösung führt; die nun ionisiert vorliegende Form des Wirkstoffs hat eine andere UV-Absorption. Der pH-Wert der Standard-/Systemeignungslösung bleibt dagegen konstant
Veränderungen, die von „außen“ kommen
Das Material der neu eingebauten Injektionsnadel ist ein wenig oder gänzlich „anders“; evtl. werden jetzt mehr/andere Metallionen herausgewaschen, die mit Bestandteilen der Probe beispielsweise Komplexe bilden. Bemerkung am Rande: Nicht nur Eisen- sondern auch Titanionen sind zur Komplexierung fähig …
Die Proben waren womöglich längere Zeit als sonst dem Sonnenlicht ausgesetzt oder es wird neulich in unmittelbarer Nähe des Autosamplers mit starkflüchtigen Aromastoffen gearbeitet
Bei der Person, die die vials vorbereitet, gab es eine – wie auch immer geartete – Veränderung, die direkt oder indirekt mit dem Handling zu tun hat, z. B: Neues Parfum oder die Hände werden nun eingecremt oder es erfolgt seit einigen Wochen eine Hormontherapie (Diffusion von Aminosäuren aus der Haut). Oder aber man hat Ihnen gesagt, dass das Schütteln eines vials generell von Vorteil sei, und Sie nahmen diese Empfehlung seit kurzem an
Neue/andere Septen bzgl. Farbe, Material, Aufbau – ihr Einfluss sollte ernst genommen werden!
Die Proben werden vielleicht im Ultraschallbad aufgelöst. Und dort gab es eine Veränderung, die wahrlich viel bedeuten kann: Neues U-Bad, z. B. rund statt eckig, statt 30 kHz jetzt 50 kHz, statt Leitungswasser jetzt destilliertes Wasser, die Wasserhöhe ist eine andere, es ist eine Gummimatte unter das U-Bad gelegt worden, die Probelösungen befinden sich jetzt in einem (größeren) Becherglas statt in einem Drahtgestell, oder aber: Es wird zwar weiterhin ein Drahtgestell verwendet, jedoch mit größeren Maschen, usw.
Das Fazit
Neue Charge von vials/Septen, kleinere Veränderungen im Handling, geänderte Matrix oder Änderungen am Probengeber bzw. an der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Anlage sind mögliche Ursachen für Veränderungen des Inhalts des vials und folglich für veränderte Chromatogramme bei sonst gleichen chromatographischen Bedingungen.
Vereinfacht gesagt, ist die Trennleistung – Effizienz, „Performance“, als Bodenzahl wiedergegeben – ein Maß für die Peakform. Eine große Bodenzahl bedeutet scharfe, symmetrische Peaks, eine geringe Bodenzahl dagegen breite, evtl. tailende Peaks. Warum ist die Peakform bei der Trennung großer Moleküle, z. B. Biomoleküle, besonders wichtig oder kritisch?
Die Lösung
Zunächst gilt es drei Punkte festzuhalten:
In der Chromatographie ist die Auflösung (Resolution, R), also der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie, das wahrscheinlich aussagekräftigste Kriterium für die Güte einer Trennung
Die Auflösung ist abhängig von der Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Maß: Retentionsfaktor k), von der Selektivität (unterschiedlich starke Wechselwirkungen zweier Substanzen, Maß: Trennfaktor α) und von der Trennleistung (Peakform, Maß: Bodenzahl, N)
Ein wichtiger Trennmechanismus bei Biomolekülen (z. B. Proteine, monoklonale Antikörper) ist die Ausschlusschromatographie, SEC
In der SEC basiert die Trennung auf unterschiedliche Molekülgrößen, eine Wechselwirkung findet definitionsgemäß gar nicht statt (sollte …). Somit entfallen bzgl. Auflösung hier zwei der drei möglichen Optimierungsparameter, nämlich Kapazität und Selektivität. Das bedeutet: Man kann in der SEC eine genügend gute Trennung nur über eine Verbesserung der Trennleistung, d.h. über die Peakform erzielen. Somit konzentrieren sich die Bemühungen bei der Optimierung einer SEC-Methode erstens auf die Unterbindung von Wechselwirkungen und zweitens auf eine Verbesserung der Peakform. Folglich kommen in der SEC bestimmten Optimierungsparametern eine gewichtigere Rolle als bei anderen Trennmechanismen zu:
Möglichst geringes Totvolumen der Apparatur, z. B. Innendurchmesser der Kapillaren < 0,13 mm, totvolumenfreie Verbindungen. Eine optimierte (!) UHPLC-Anlage ist hier von unermesslichem Vorteil – insbesondere bei der Verwendung moderner SEC-Säulen (eher kurz, eher dünn, eher kleine Teilchen), siehe Abbildung 1 und 2
Stark verdünnte Probelösungen
Möglichst kleine Flussraten
Optimale Einstellparameter, z. B. Zeitkonstante < 0,1 s, Spalt 16 nm
Lange Säulen, kleine Korngröße, Core Shell-Matrix
Physisorption/Adhäsion durch möglichst inerte Oberflächen verhindern, z. B Peak-lined Säulen, metallfreie Materialien im Fluidpfad, Vials mit inertisierter Oberfläche
Hohe Konzentration an Natriumperchlorat/Kaliumchlorid im Eluenten
Je ein Beispiel von Waters und Agilent sollen den Einfluss des Totvolumens auf die Auflösung in Fällen, wie den hier besprochenen, demonstrieren:
In Abbildung 1 führt der Wechsel einer 0,17 mm-Kapillare zu einer 0,07 mm-Kapillare dazu, dass ein Aufsetzerpeak immerhin sichtbar wird. Selbstverständlich sollte in diesem Zusammenhang an die erhöhte Gefahr von Niederschlag in sehr dünnen Kapillaren hingewiesen werden.
In Abbildung 2 wird die Verbesserung der Auflösung einer SEC-Methode aufgrund des kleinen Dispersionsvolumens in einer UPLC-Anlage (18 µl) dargestellt. Bemerkung: Für andere Trenntechniken wäre das Dispersionsvolumen (im Alltag kann man ruhig von „Totvolumen“ sprechen) von 30 µl der HPLC-Anlage vollkommen ausreichend.
zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.
Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.
In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.
1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit 2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen) 3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle 5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen 6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR, A = konstant
1. Eluent 2. ∆ stationäre Phase 3. ∆ Temperatur
1. ∆ P
3. ∆ P
Stets: t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch ∆ Peakform
1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H, A = konstant
∆ Packungsqualität
tR = konstant,
Verschlechterung der Peakform
∆ tR, ∆ t0, ∆ A, H = fast konstant
∆ Fluss
∆ P
Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform – alle Peaks
1. Totvolumen 2. Verschlechterung der Packungsqualität
tR = konstant
Schlechte Peakform – einige Peaks
∆ pH-Wert
Betroffene Peaks: ∆ tR
Etwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks
1. Hohlraum im Packungsbeet 2. Verbogene Injektionsnadel 3. Substanz liegt in zwei Formen vor
Typischen Symptomen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden; oder aber die Zahl der infrage kommenden Ursachen kann durch Beurteilung der Symptome („Welche Veränderung kann dieses Symptom bedingen und welche definitiv nicht?“) wenigstens eingegrenzt werden. Nachfolgend werden beispielhaft sieben häufige „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. Bei Bedarf erfolgt auch ein Kommentar. Für die vorgestellten Fälle gelten folgende Annahmen: Keine bewusste Änderung seitens der Anwender:innen, z. B. es wurde keine längere Säule eingebaut Es handelt sich vorwiegend um RP-Trennungen mit einem konzentrationsempfindlichen Detektor wie beispielsweise UVVis, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor Weiter unten sind die häufigsten Ursachen genannt Symbole: ∆: Änderung H: Peakhöhe A:...
Der Fall Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage? Die Lösung Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind. Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen: Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem...
Der Fall Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert...
Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen „Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse Temperatur Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen? Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei...
1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn 2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX) Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B....
Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆...
Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung: „Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“ „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern. „Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen...
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Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp): Katalytische Wirkung des Kieselgels Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit...
Der Fall Das Ultraschallbad wird häufig auch zum Auflösen von Proben verwendet. Sein Einfluss auf die späteren chromatographischen Ergebnisse sollte nicht unterschätzt werden. Im Falle von schwankenden Peakflächen sollte ggf. an mögliche Variabilitäten im Zusammenhang mit dem Ultraschallbad gedacht werden. Die Lösung Es existieren verschiedene Einflussfaktoren, von denen hier einige aufgeführt sind: Verteilung der Energie/Temperatur Welches Wasser wird verwendet, Leitungs- oder destilliertes Wasser? Wie ist der Wasserstand? Bei hohem Wasserstand: Geringe Energie, dafür jedoch homogen verteilt. Niedriger Wasserstand: Erhöhte Energie, dadurch effektiveres Auflösevermögen. Durch die höhere Temperatur besteht allerdings eine größere Gefahr von Hydrolyse, Umlagerung...
