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A FehlersucheMonatstippPeakverbreiterungpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)Veränderung der PeakflächeVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

Der Fall

Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage?

Die Lösung

Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind.

Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen:

Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen

  • Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem rechtzeitig zu erkennen, ob also Gefahr für Niederschlag besteht (Tipp von Jens Braun, BioChem): Probelösung einfach kalt machen und anschließend zentrifugieren

Temperatur zum Zweiten: Bessere Peakform, Zunahme der Peakfläche

  • Wenn die Standard-/SST-lösung organischer als der Eluent/Anfangsgradient ist, entsteht Fronting, mitunter bei sehr frühen Peaks auch „Buckel“. Wenn nun aus jener Lösung im Laufe der Sequenz häufig injiziert wird, kann das organische Lösungsmittel u.U. verdampfen, Ergebnis: Aufkonzentrierung der Probe im Vial, die Peakfläche nimmt zu und dadurch, dass nun die Probelösung womöglich „Eluent-ähnlicher“ geworden ist, ergibt sich eine Verbesserung der Peakform

Temperatur zum Dritten: Zunahme der Peakfläche und/oder größerer Variationskoeffizient

  • Eine häufige Praxis: Damit bei einer Verwendung von vorgeschlitzten Septen kein Lösungsmittel aus dem Vial entweichen kann, wird die Temperatur des Probengebers gesenkt. Die Peakflächen nehmen mit der Zeit evtl. zu, eine mögliche Ursache wäre: Die Ansaug- (aspiration time) – aber auch die Injektionsgeschwindigkeit! – wurde der sich geänderten Viskosität nicht angepasst. Injektionen von viskosen Probelösungen bei relativer großer Ansauggeschwindigkeit führen ferner zu großen Variationskoeffizienten (unreproduzierbare Peakflächen)

Geisterpeaks, die erst später erscheinen

  • In Tetrahydrofuran von HPLC-Qualität sind erwartungsgemäß keine Stabilisatoren enthalten. Wenn nun die THF-Flasche etwas älter und auch keine Stickstoff-Atmosphäre vorhanden ist und die Flasche weder mit Alufolie umwickelt ist noch im dunklen Schrank/Kühlschrank aufbewahrt wird, können Peroxide entstehen. Diese sammeln sich am Säulenkopf und eluieren erst später gegen Ende eines Gradientenlaufs

Verschiebung der Retentionszeit verbunden mit Veränderung, meist Verschlechterung, der Peakform  

  • Durch eine etwas „schiefe“ Bewegung des Kolbens in der Pumpe kann Eluent in die Flüssigkeit der Hinterkolbenspülung gelangen. Überprüfung: Die Flüssigkeit vermehrt sich auf wundersamen Weisen, auch ein einfacher sensorischer Test offenbart das Problem. Durch eine derartige, zwar geringe jedoch stete Veränderung der Eluentenzusammensetzung ergibt sich eine schleichende Retentionszeitverschiebung
  • Bei bestimmten nicht-silanisierten Vials kann der pH-Wert einer wässrigen Probelösung innerhalb einer Stunde u.U. sich um mehr als eine pH-Einheit ändern
  • Bestandteile der Probe verändern im Laufe der Zeit das Füllmaterial der Säule, die Wechselwirkungen ändern sich ebenso, z. B. Schwermetallionen belegen die Kieselgelmatrix, Matrixbestandteile wie Stärke, Fette, Dextrane, Fette, Propylenglykol usw. die Oberfläche der stationären Phase – die Probleme erscheinen erst mit der Zeit …

Das Fazit

Vor der Adaption einer Methode in der Routine ist es im Falle von vorgesehenen langen Sequenzen ratsam, die Stabilität chromatographischer Größen wie Retentionszeit und Peakfläche über die Zeit gezielt zu testen. Oft werden bei der Methodenentwicklung keine langen Sequenzen verwendet, mögliche Probleme bleiben somit am Anfang im Verborgenen.

sk
30. September 2022
A FehlersucheJahrestippspH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)pH-Wert des Eluenten

Gründe für eine Verschiebung des pH-Wertes

Der Fall

Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten?

Die Lösung

Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz

  • Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert des Eluenten, er driftet ins Alkalische, z. B: pH-Wert eines wässrigen Phosphatpuffers, 2,2, nach der Zugabe von 70 % Methanol ergibt sich ein „pH-Wert“ von ca. 4,0, nach der Zugabe von 70 % Acetonitril von ca. 3,0
  • Es wird der falsche Puffer verwendet, also ein Puffer, der im betreffenden pH-Wert-Bereich keine Pufferwirkung aufweist, z. B. Acetatpuffer bei einem eingestellten pH-Wert von 3,0
  • Es wird lediglich ein Salz und kein Puffer verwendet; oder aber man/frau spricht von „Puffer“, aber es wird lediglich angesäuert (z. B. 0,1 % TFA, Trifluoressigsäure)
  • Der verwendete Puffer ist recht schwach; so hat man/frau nicht die Gewähr, dass ein 5 oder 10 mM-Puffer einen bestimmten pH-Wert konstant halten kann, wenn die Probe selbst und/oder ein Modifier im Eluenten stark basisch/sauer ist (z. B. Triethylamin)
  • Die Matrix kann den pH-Wert der Probelösung beeinflussen; man/frau denke nur an Magnesiumcarbonat in einer Tablette oder an eine Kaffeeextrakt-Lösung
  • Die Glasoberfläche eines vials (dort befinden sich ja auch Silanolgruppen) kann den pH-Wert einer wässrigen Probelösung verändern; je nach Fabrikat kann es mehr als eine pH-Einheit ausmachen
  • Es herrscht eine pH-Wert-Differenz zwischen stationärer und mobiler Phase; eigene Messungen haben ergeben, dass je nach verwendetem Basiskieselgel der pH-Wert einer 5 %igen Kieselgel-Suspension zwischen ca. 2,0 und 8,5 betragen kann
  • Variabilität beim Ansetzen der mobilen Phase bzw. bei der Probenvorbereitung, hier einige Beispiele:
  • Bei einem schnellen Einfüllen und somit hohen Lufteintrag (CO2!) kann der pH-Wert von HPLC-Wasser auf ca. 5,5 – 5,7 sinken
  • Saure Dämpfe aus dem Abzug oder über die Klimaanlage in einem Industriegebiet
  • Ungenaue Angaben in der Prüfvorschrift bzw. kein exakt gleiches Handling in zwei Labors, die mit einer Methode arbeiten, z. B: „… mit Phosphorsäure pH-Wert X einstellen …“: 85 % H3PO4 1 Mol/L, einmal 13 ml und einmal 11,3 ml zum Einstellen, oder: Wird der pH-Wert mit KH2PO4, mit K2HPO4 oder mit K2HPO4.2 H2O eingestellt?
  • Unterschiedliche Extraktionszeit kann den pH-Wert beeinflussen
  • Eine gut gemeinte Aktion birgt „Gefahren“ … So kann eine „kleine“ Änderung evtl. eine pH-Wert-Verschiebung bewirken, z. B: Eine LC-MS-Methode liefert nicht die gewünschte Selektivität; daraufhin wird die 0,1 %ige Essigsäure gegen eine 0,1 %ige Ameisensäure ersetzt. Nur im ersten Fall haben wir einen pH-Wert von ca. 3,3, im zweiten von ca. 2,7. Oder, man/frau möchte mit dem Ziel einer pH-Wert-Stabilität statt der 0,1 %igen Ameisensäure einen 10 mM Ammonium-Formiatpuffer verwenden, jene wässrige Phase wird auch als Diluent verwendet. Das Ammoniumsalz kann jedoch mit der SiO2-Oberfläche des vials reagieren …
  • Folgende Ursachen dürften von geringer Relevanz sein, dennoch seien sie hier kurz erwähnt:
    – Verschiebung der Temperatur
    – Bakterien und weitere Mikroorganismen können kleine organische Säuren
    freisetzen

Das Fazit

Es gibt mehrere mögliche Ursachen für eine Verschiebung des pH-Wertes. Falls ein Verdacht für eine solche besteht, gäbe es folgende einfache Tests, um wenigstens das Problem zu lokalisieren: Messen Sie einfach den pH-Wert nach unterschiedlichen Zeiten und vergleichen Sie die Werte miteinander:

  • pH-Wert des frisch angesetzten Eluenten, dann nach 2-3 Stunden sowie den pH-Wert des Eluats (also das, was nach der Säule eluiert)
  • pH-Wert der Probelösung im vial zu Beginn und am Ende der Sequenz

Diese Vergleichsmessungen eignen sich demnach auch in folgenden Fällen:

Neue Charge von vials, neue Ionenaustauscher-Kartusche in der Wasseraufbereitungsanlage, neue Mitarbeiter:in/anderes Handling, neues Kontrakt-Labor, variierende Matrix usw.

 

sk
9. September 2022
A FehlersucheAuto-SamplerBodenzahlInjektionsvolumenJahrestippskleine PeaksProbengeber

Zwei kleine Sommer-Tipps

Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen

„Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse

Temperatur  

Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen?

  • Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei 10 °C

Abb. 1 Unterschiedliche  Beeinflussung von Selektivität und Retentionszeit bei einer Änderung der Temperatur, Details, siehe Text

  • Die Trennleistung (= Effizienz), also letzten Endes die Peakform, kann sich bei einer Temperaturerhöhung um ca. 4 °C, T1 auf T2, nur minimal (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Val-Phase“, Abbildung 2) oder auch merklich verbessern (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Pro-Phase“, Abbildung 2). Das Ausmaß ist demnach abhängig – auch von der Säule

 

Abb. 2 Abhängig von der Säule, merkliche oder geringe Verbesserung der Peakform bei einer Temperaturerhöhung, Details, siehe Text

Selbes Gerät, unterschiedliche Ergebnisse

An einem qualifizierten und technisch einwandfreien Gerät ergeben sich womöglich unterschiedliche Ergebnisse; „unterschiedliche Ergebnisse“ kann Änderung der Retentionszeit, der Peakform, der Reproduzierbarkeit der Peakfläche oder auch der Peakform bedeuten. Das kann mit einer unterschiedlichen Arbeitsweise des Gerätes oder unbeabsichtigte Verwendung unterschiedlicher Verbrauchsmaterialien zusammenhängen. Nachfolgend sind einige Beispiele aufgeführt:

  • Bei einem Säulenluftofen wird einmal die Arbeitsweise „Ruhluftofen“ und einmal „Umluftofen“ (aktive Umwälzung der Luft) gewählt. Ferner: Es kann schon etwas ausmachen, wo genau im Säulenofen die Säule sich befindet …
  • Einmal wird die Ansauggeschwindigkeit („Aspiration time oder period“) der Viskosität der Probelösung angepasst, einmal nicht
  • Einmal werden Luftblasen verwendet, um eine Peakverbreiterung zwischen Probengeber und Säule zu verhindern, einmal nicht
  • Einsätze („vial oder micro-inserts“) für die vials im Falle von kleinen Injektionsvolumina können unterschiedliche Länge und Durchmesser aufweisen. Vor allem letzterer kann das Entstehen einer Luftblase am unteren Ende und dadurch die Reproduzierbarkeit der Injektion beeinflussen, siehe Abbildung 3. Ein Luftbläschen kann gut mit Hilfe einer Lupe erkannt, ggf. durch kräftiges „Tippen“ mit dem Finger entfernt werden

 

Abb. 3 Unterschiedliche Dimensionierung von „inserts“ kann die Reproduzierbarkeit der Injektion beeinflussen, Details, siehe Text

 

 

 

 

sk
12. Juli 2022
AllgemeinAuflösungB OptimierungBodenzahlJahrestippsProbenlösungsmittel

Die „Kleinen“ im Sommer …

1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn

2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen

 

  1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn
  • An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX)
  • Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks
  • Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung
  • Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B. 70/30 Iso-OH/Wasser) ist zum Entfernen von Mikroorganismen effektiver als beispielsweise eine starke, z. B. eine 90 oder 100 % Iso-OH-Lösung. So auch mit Wasserstoffperoxid: Eine 3 % ige H2O2-Lösung ist effektiver als z. B. eine 10 % -ige
  • Substanzen bleiben aus schwach-konzentrierten Probelösungeneher als aus stärker-konzentrierten durch Adhäsion oder Physisorption an allerlei Oberflächen „hängen“ (Memory-Effekt)

 

     2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen

Vorbemerkung:

Der Einfachheit halber unterstellen wir hier einen isokratischen Lauf, die Aussagen gelten jedoch grundsätzlich auch für Gradientenläufe.

Folgender fiktiver Fall:

Die Effizienz Ihrer Säule beträgt 10.000 Böden, bei den aktuellen chromatographischen Bedingungen erreichen Sie eine Selektivität von 1,01 zwischen den zwei interessierenden Peaks und der k-Wert – also die Kapazität, ein Maß für die Stärke der Wechselwirkungen – des ersten interessierenden Peaks beträgt 3: Das bedeutet, der Peak eluiert nach der dreifachen Totzeit.

Mit diesen drei Werten an Effizienz, Selektivität und Kapazität ergibt sich eine Auflösung (Abstand der zwei Peaks an der Peakbasis) von 0,19, eine Trennung ist schlicht nicht gegeben. Von einer akzeptablen Trennung spricht man ab einem Wert für die Auflösung (Resolution) von ca. 1,0. Was tun? Oder vielleicht zunächst: Was ist nicht zu empfehlen?

Versuchen Sie nicht die Effizienz oder die Kapazität zu erhöhen, das ist recht uneffektiv, also: Nehmen Sie keine längere Säule oder kleinere Teilchen (Erhöhung der Effizienz) oder eine noch hydrophobere C18-Säule bzw. eine wasserreichere mobile Phase (Erhöhung der Wechselwirkung, also der Kapazität).

Zahlenbeispiel:

Nehmen wir an, Sie erhöhen Effizienz und Kapazität – aus ökonomischen Gründen am besten ja beides gleichzeitig – jeweils um Faktor 2, also auf 20.000 Böden und auf einen k-Wert von 6. Das erreichen Sie, indem Sie eine doppelt so lange Säule oder halb so große Teilchen verwenden und beispielsweise den wässrigen Anteil – je nachdem – um 10-20 % erhöhen. Die Auflösung verbessert sich dadurch von 0,19 auf lediglich 0,30 – wohl kaum erwähnenswert …

Es ergibt sich zwangsläufig, dass es besser ist, die Selektivität zu erhöhen; in der Tat, das ist die effektivste Maßnahme. Angenommen, es gelingt bei der Anfangseffizienz von 10.000 Böden und der Kapazität von 3 die Selektivität nun auf 1,10 zu erhöhen. Die Auflösung verbessert sich von 0,19 auf ca. 1,70!

Wie kann die Selektivität in einem RP-System gezielt verbessert werden? Änderung des pH-Wertes, Änderung des organischen Lösungsmittels (z. B. Acetonitril gegen Methanol ersetzen) und Änderung des Liganden der stationären Phase. Also statt einer anderen C18-Säule – geschweige denn eine längere – lieber beispielsweise eine Biphenyl, eine PFP oder eine Mixed Mode Phase ausprobieren. Diese drei Maßnahmen sind effektiv und somit empfehlenswert.

 

 

sk
27. Mai 2022
A FehlersucheApparaturEinstellparameterJahrestippsLebensdauer der SäulePeakverbreiterungTotvolumen

Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Der Fall

Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein?

Die Lösung

Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden:

1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät
2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“

Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt.

  1. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung
  • ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz
    (∆ Peakfläche, ∆ Peakform)
  • Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform)
  • Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare einer kurzen und dicken vorzuziehen; bei zweiter Variante ist das Dispersionsvolumen nämlich kleiner
  • Ist der Eluent bereits vorgemischt oder übernimmt das Gerät das Mischen?
    (∆ Retentionszeit)
  • Genaue Positionierung der Säule in einem Umluftofen (∆ Retentionszeit, evtl. ∆ Peakform)
  • In einem Labor werden die Proben angesetzt und man startet direkt die Sequenz. In einem anderen Labor werden viele Proben für mehrere Messplätze von einer Person angesetzt, anschließend werden sie verteilt. Im zweiten Fall befinden sich die Proben eine längere Zeit in den vials. Je nach Beschaffenheit der Glasoberfläche kann sich der pH-Wert einer wässrigen Probelösung nach einer Stunde im vial um mehr als eine pH-Wert-Einheit ändern. Oder aber im ersten Labor ist die Sequenz viel kürzer als im zweiten
    (∆ Retentionszeit, ∆ Peakform, evtl. ∆ Peakfläche)
  • Saphir- oder Keramikkolben? (Anfälligkeit gegenüber Salzen, Leckage möglich, dadurch ∆ Eluentenzusammensetzung und folglich ∆ Retentionszeit)
  1. Unterschiedliche Handhabung der Anlage

Die meisten modernen UHPLC/HPLC-Anlagen verfügen über nützliche Funktionen, die allerdings manchmal bewusst aktiviert werden müssen, nachfolgend einige Beispiele:

  • In einem Fall werden Luftblasen zur Vermeidung von Peakverbreiterung auf dem Weg der Probe vom Probengeber zur Säule erzeugt, im anderen Fall ist diese Funktion deaktiviert (∆ Peakform)
  • Ebenso: Kompressibilitätskorrektur „on“/“off“; automatische Korrektur oder muss jene manuell aktiviert werden? (∆ Peakform)
  • „Cooling“-Funktion (um zu verhindern, dass die Probe nach der Säule „warm“ am Detektor ankommt) aktiviert/nicht-aktiviert (∆ Peakform)
  • Läuft der Eluent permanent oder erfolgt während der Injektion eine Unterbrechung? Im zweiten Fall erfasst nach jeder Injektion eine Druckwelle die Säule (∆ Lebensdauer der Säule)
  • Wird die Ansaug- und Injektionsgeschwindigkeit automatisch der Viskosität der Probelösung angepasst? (∆ Präzision)

Das Fazit

Oft sind solche „Kleinigkeiten“ nur vor Ort zu entdecken. Oder aber man hat Glück und kommt bei einer „penibel-höfflichen“ Fragerei während eines Calls dahinter…

 

 

 

sk
31. März 2022
AllgemeinJahrestippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky und Chromy beim Denksport

Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung:

„Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“

  • „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern.

„Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen Peak liefert?“

  • „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“

Schlechte Packungsqualität und Totvolumen sind Substanz-unspezifische Problemquellen. Liegt eine solche vor, so ergibt sich stets – unabhängig von der Natur der injizierten Komponente – eine schlechte Peakform.

„Warum müssen die Substanzen in dieser Probe stark polar sein?“

  • „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“Wenn trotz geringer Konkurrenz um die Gunst der C18-Borsten seitens der Moleküle in der mobilen Phase (nur 10 % organischer Anteil) Substanzen an den hydrophoben C18-Borsten kaum haften können, müssen sie wohl sehr polar sein.

„Wieso tippst du auf eine Änderung der Flussrate?“

  • „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“Bei einer Änderung der Flussrate ändert sich im Falle eines konzentrationsempfindlichen Detektors, wie dem UV, nur die Peakfläche. Im Idealfall ändert sich die Peakhöhe überhaupt nicht, in der Praxis schon ein wenig.

„Wieso bist du sicher, dass sie eine isokratische Methode verwendet haben?“

  • „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate nicht – deswegen weiß ich es“Physikalische Parameter wie Säulenlänge, Fluss und Totvolumen beeinflussen im isokratischen Modus die Elutionsreihenfolge nicht. Im Gradientenmodus kann eine Änderung solcher mitunter zu einer Änderung der Elutionsreihenfolge führen. Merke: Bei einer Gradientenanlage spielt nicht das Totvolumen sondern das Verweilvolumen die entscheidende Rolle.

„Warum verwendest du für polare Komponenten im Eluenten Methanol statt Acetonitril?“

  • Weil Methanol in solchen Fällen häufig die bessere Selektivität aufweist“Die Erklärung steckt bereits in der Antwort: Für polare Komponenten ist die Selektivität in Methanol meist besser als in Acetonitril: Methanol unterbindet polare Wechselwirkungen nicht

„Warum vermeidest du für Routinemethoden nach Möglichkeit polare RP-Phasen?“

  • „Sie machen im Alltag generell mehr Probleme, auch deren Chargenreproduzierbarkeit lässt zu wünschen übrig“Auch hier steckt in der Antwort ein bekanntes Dilemma: Polare stationäre Phasen – ob lediglich welche mit polaren Gruppierungen oder auch Mixed Mode Phasen – sind zwar bzgl. Selektivität sehr interessant, bereiten jedoch häufiger Probleme als klassische C18-Phasen.

„Warum überprüft ihr bei jeder neuen Charge vials und Septen? Ist es nicht ein wenig übertrieben?“

  • Wir haben des Öfteren festgestellt, dass – neben der Injektionsnadel und der Purgeflüssigkeit – ihr Einfluss auf Peakform und Flächenreproduzierbarkeit enorm sein kann“Die Beschaffenheit der Glasoberfläche bei vials und die Art der Septen (dunkel- vs. hellrot, Silikoncharge etc.) können tatsächlich viel bewirken, bis hin zu (temporären) Geisterpeaks.
sk
28. Februar 2022
AllgemeinJahrestippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky & Chromy beim Denksport

Peaky ist wegen der doch sehr lange anhaltenden Pandemie und dem speziellen Jahresstart immer noch richtig „aufgekratzt“, er lässt den armen, gemütlichen Chromy – nach einem schnellen, obligatorischen „Ein gutes, neues Jahr 2022“ – einfach nicht in Ruhe. Chromy bleibt nichts anderes übrig als auf ihn einzugehen, er kann ja später mit den C18-Borsten weiter flirten.

Peaky: Du Chromy, wir wollen etwas spielen, OK? Und weil Du sooo gescheit bist, sollst Du Dich etwas anstrengen. Also: Ich präsentiere Dir Antworten und Du sollst Dir eine vernünftige, passende Frage überlegen. Und hör mal: Ich habe nicht so viel Zeit, die Silanole warten schon auf mich, also denk´ ratzfatz.

Er setzte sein schelmisches Lächeln auf und legte los:

  • „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“
  • „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“
  • „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“
  • „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“
  • „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate nicht – deswegen weiß ich es“
  • Weil Methanol in solchen Fällen häufig die bessere Selektivität aufweist“
  • „Sie machen im Alltag generell mehr Probleme, auch deren Chargenreproduzierbarkeit lässt zu wünschen übrig“
  • Wir haben des Öfteren festgestellt, dass – neben der Injektionsnadel und der Purgeflüssigkeit – ihr Einfluss auf Peakform und Flächenreproduzierbarkeit enorm sein kann“

Liebe Leserinnen, liebe Leser,

vielleicht haben Sie gerade mitten im Winter etwas Zeit und Lust sich passende Fragen zu überlegen. Falls ja, wünsche ich Ihnen viel Spaß dabei und viel Erfolg.

Senden Sie die passenden Fragen bis zum 25.02.2022 an info@kromidas.de. Die Gewinnerin/der Gewinner – bei mehreren richtigen Antworten entscheidet das Los – erhält das von mir gerade herausgegebene Buch „HPLC optimal einsetzen, Konzepte und Strategien für Methodenentwicklung und –optimierung“.

 

 

 

 

 

 

 

sk
3. Januar 2022
AllgemeinBehältnisseC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGeisterpeaks & negative PeaksMethodentransferMonatstippNachweisgrenzeOptimierungVeränderung des Chromatogramms

Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Geisterpeaks – aber erst „später“
Verbesserung der Empfindlichkeit

Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen

Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):

          Katalytische Wirkung des Kieselgels

  • Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit spät eluieren. Sind solche Substanzen in der Probe enthalten, so erscheinen evtl. Geisterpeaks. Fehlen diese Komponenten, eluieren nur Komponenten, die schwache Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen, die Geisterpeaks fehlen

    Verstärkt Hydrolyse durch ungewollte Veränderung chromatographischer Parameter
  • Stellen wir uns eine lange Sequenz vor: bei den gegen Ende der Sequenz zu injizierenden Proben herrscht im vial evtl. eine andere Temperatur als bei den Proben davor (z. B. Temperaturdifferenz Kühlschrank-Probengeber oder Temperaturgradient im Probenraum des Probengebers)
  • Auch folgendes wäre im Falle einer langen Sequenz denkbar: der pH-Wert im vial ändert sich mit der Zeit – aus welchen Gründen auch immer – und ab einem bestimmten pH-Wert sind allerlei Veränderungen der Probe denkbar und somit erscheinen zusätzliche Substanzen erst nach einer gewissen Zeit

    Oxidationsprodukte
  • Man/frau arbeitet mit Tetrahydrofuran (THF) in der mobilen Phase; ein Blindgradient zu Beginn zeigt keine Probleme. Mögliche Peroxide aus dem THF sammeln sich allerdings erst mit der Zeit an der Säule und erscheinen nach einer Zeit X als Geisterpeaks gegen Ende des Gradienten. Man/frau wundert sich wieso erst nach so und so vielen Stunden bei den Nachtläufen Geisterpeaks auftauchen…
  • Trotz sicherlich Endreinigung der Dichtungen vor Auslieferung, kann eine Rest-Fettschicht auf deren Oberfläche vorhanden sein. Deren Oxidationsprodukten (z. B. N-Oxide) können als Geisterpeaks erscheinen, die Anzahl und der Zeitpunkt kann von der Arbeitsweise abhängig sein: Anzahl der Läufe, Temperatur, Eluent, Zusammensetzung der mobilen Phase bei der Lagerung usw.Auffüllen des Vorratsgefäßes
  • In Acetonitril können Polymere entstehen. Wird das Vorratsgefäß stets aufgefüllt sobald ca. die Hälfte des Lösungsmittels aufgebraucht ist, gibt es keine Probleme, deren Konzentration ist gering. Erfolgt das Auffüllen nicht immer zum gleichen Zeitpunkt, kann passieren, dass bei geringer Flüssigkeitsmenge im Vorratsgefäß die Polymer-Konzentration derart hoch ist, dass neben „Wellen“ in der Basislinie auch Geisterpeaks erscheinen. Also frei nach Giovanni Trapattoni: „Flasche voll: Keine Probleme, Flasche (fast) leer: Probleme

Verbesserung der Empfindlichkeit

Über das Thema haben wir uns an dieser Stelle bereits mehrfach unterhalten. Da es wichtig ist, möchte ich weiter unten die aus meiner Sicht effektivsten Maßnahmen verdichtet zusammenfassen. Das Ziel lautet: Möglichst große, schmale, symmetrische Peaks.

  1. Optimale Bedingungen bezüglich Hard- und Software:
  • *Geringes Dispersionsvolumen (vereinfacht: Totvolumen)
  •   Notwendig bei bestimmten Analyten: Inerte/Bio-inerte/Metall-freie Anlage und inerte bzw. Peek-ummantelte Säule,    silanisierte vials
  • *Falls möglich, mit Luftsegmenten zwischen Probengeber und Säule arbeiten, um eine Verdünnung der Substanzzone
    zu verhindern
  • *Optimale Settings, z. B. mindestens 40 Datenpunkte, 16 nm Spalt, 50 ms Zeitkonstante, Rauschen-Unterdrückung
  •   Je nach verwendeter Detektionsart und Analyt-Stabilität das technisch maximal Machbare nutzen, z. B: Max-
    Light/LightPipe (UV), Triple Quad MS (LC-MS), ICP-MS
  1. Chromatographische Parameter:
  • Nach Möglichkeit kurze, in jedem Fall dünne Säulen; wenn die Voraussetzungen gegeben sind, evtl. auch an Kapillaren denken
  • Core Shell- (1,3-1,7 µm) oder falls es porös sein muss, Sub2µm-Material
  • *Stets schwächeres Probelösungsmittel im Vergleich zum Anfangsgradienten verwenden: Anreicherung der
    Substanzzone am Säulenkopf; ggf. mit Hilfe eines Schaltventils Anreicherung in einer Trap-Säule in Erwägung ziehen
  • *Steiler Gradient mit 30-40 % B beginnend
  • *Bei thermostabilen Komponenten tendenziell bei höheren Temperaturen chromatographieren

Die mit „*“ versehenen Maßnahmen sind relativ schnell umzusetzen, der Rest ist mit einem gewissen Aufwand verbunden, der Nutzen kann nur individuell bewertet werden.

sk
1. Mai 2021
HPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky und Chromy in der Säule

Der HPLC-Tipp im Dezember Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen, es ist eine Zeit her, dass wir den kleinen Peaky Säure und den großen Chromy von Hydrophobenhausen haben zu Wort kommen lassen. Nun ist es wieder soweit, horchen wir Ihnen einfach – nur wo sind sie denn? Klar doch: Peaky der schnelle und Chromy der langsame schlendern gemütlich durch die Säule. Peaky: Du Chromy, ich bin soooo froh, dass wir keine Maske tragen müssen. Unser Abstand zwischen uns ist soooo groß, da kann wirklich nichts passieren, juhu! (Peaky zeigt dem Corona-Virus frech die Zunge und hantiert noch an seine Nase herum). Chromy:...
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sk
19. Dezember 2020
A FehlersucheAuflösungHPLC-TippsSpülen, Reinigen & EquilibrierenSystemeignungstest (SST)Uncategorized

Die Kleinen im Sommer: Permanent auftretender Geisterpeak, Faustregeln zu Log P und Log D, Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache

  Permanent auftretender Geisterpeak Faustregeln zu Log P und Log D Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache Seit kurzem erscheint ein Geisterpeak bzw. stets ein Blindwert im Blank… Seit einiger Zeit taugt bei einer Methode – oder bei mehreren – die noch vor kurzem keine Probleme machte(n), ein Geisterpeak auf. Oder aber, Sie haben in Ihrem Blank auf einmal stets einen Blindwert. Und dieses Problem haben Sie unabhängig von der Anlage, dem/der Anwender(in) und sogar der Methode. D.h. das übliche Fehler-Ausschluss-Programm haben Sie gründlich aber leider erfolglos absolviert. Versuchen Sie in einem solchen Fall im Team sich zu erinnern,...
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2. Juli 2020
ApparaturAuflösungB OptimierungBodenzahlEinstellparameterHPLC-TippsInjektionsvolumenOptimierungProbenlösungsmittelTotvolumenVeränderung des Chromatogramms

Regulierter Bereich, feststehende Prüfvorschrift, geforderte Auflösung wird nicht erreicht – was ist möglich?

Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,...
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3. Mai 2020
HPLC-TippsHPLC-Tipps DemoSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Effektives Spülen einer HPLC-RP-Säule – und Verifizierung des Erfolges

Der Fall Eine RP-Säule sollte ab und an gespült werden; erfahrene AnwenderInnen wissen wie, z. B: „Übliche“ Spülprozedur, oft vollkommen ausreichend: 70-80% Acetonitril (ACN)- oder Methanol (MeOH)-Wasser-Gemisch Imfalle von polaren Verunreinigungen: 90-95% H2O, Rest: ACN oder MeOH Imfalle von apolaren Verunreinigungen: 80-100% ACN oder MeOH Soweit, so gut – nur: Bei unbekannten Verunreinigungen müsste man – um des Erfolges sich recht sicher zu sein – einmal mit „viel“ Wasser und einmal mit „viel“ ACN spülen, was schon zeitaufwendig ist. Ferner: Bei unbekannten Verunreinigungen und/oder „schwieriger“ Matrix ist man nach etwaiger Spülprozedur doch unsicher, in wieweit sie erfolgreich verlaufen ist. Gibt...
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8. März 2020
B OptimierungEluentHPLC-TippsOptimierungpH-Wert des EluentenSäuleVeränderung des Chromatogramms

Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen/erniedrigen?  

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über folgenden Tatbestand unterhalten: Wenn ich in der HPLC einen physikalischen Parameter verändere, ist das Ergebnis selten eindeutig „gut“ oder „schlecht“. Je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen überwiegen Vor- oder eben Nachteile. Dies gilt analog auch für chemische Parameter. Hier wollen wir stellvertretend sechs solcher betrachten, siehe Tabelle 1. Die Lösung   Was Nachteile Vorteile Erhöhung der Temperatur In der Regel Abnahme der Selektivität und der Lebensdauer der Säule, ferner erhöhte Gefahr für  Zersetzung von thermolabiler Analyten Abnahme der Retentionszeit und des Druckes, Verbesserung der Peakform und dadurch Zunahme der Peakkapazität (Anzahl der...
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2. Februar 2020
A FehlersucheB OptimierungHPLC-TippsHPLC-Tipps DemoSäuleVerweilvolumen

Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen?  

Der Fall Selten sind Eigenschaften eindeutig nur als positiv oder als negativ zu bezeichnen. So hat ein Ferrari zwar Vorteile. Wenn ich allerdings mit diesem Vehikel und mit meinen vier Kindern und mit meiner Schwiegermutter und mit unserem Hund Mitte August nach Griechenland fahren will, wird es gelinde gesagt mindestens „interessant“…Genauso verhält es sich mit Änderungen. Sie bescheren selten nur „gute“ oder nur „schlechte“ Ergebnisse, so auch in der HPLC: Wenn ich einen Parameter verändere, ergeben sich je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen Vor- oder eben Nachteile. In Tabelle 1 finden Sie sechs physikalische Parameter mit einer differenzierten Betrachtung deren Auswirkungen....
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4. November 2019
AuflösungB OptimierungEluentHPLC-TippsOptimierungPeakverbreiterungpH-Wert des EluentenUncategorized

Zusätze in der Probelösung  

Der Fall Additiva (Modifier) oder einfache Zusätze wie Salze in der mobilen Phase können die Trennung positiv beeinflussen, ihr Einsatz bewährt sich seit Jahrzehnten. So kann beispielsweise die Peaksymmetrie und dadurch indirekt die Empfindlichkeit durch Verwendung von etwa Di- oder Triethylamin, DEA/TEA, Di-Tri- oder Fluoressigsäure, DFA/TFA/FA, Ionenpaarreagenzien wie Heptan- oder Oktansulfonsäure erhöht werden. Das Problem dabei: Solche Additiva werden teilweise an der Oberfläche der stationären Phase (irreversibel) adsorbiert, was in der Routine vielleicht ein geringe(re)s Problem darstellt. In der Methodenentwicklung jedoch ist dies störend, weil ja nach jedem Experiment die Säule mühsam durch Spülen wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht...
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3. Oktober 2019
EluentFrittenGradientHPLC-TippsLösungsmittelUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer… Die Themen:  Lösungsmittel, Teilchengröße, Gradient

Zur Qualität von Lösungsmitteln für die HPLC – wann, was? Sowohl „Gradient grade“ als auch „LC-MS grade“ sind sehr reine Lösungsmittel – worin liegt nun der Unterschied? Wie die Bezeichnung es ahnen lässt: Gradient grade Lösungsmittel sind speziell für die spektroskopischen Detektoren (Fluoreszenz- und vor allem UV-Detektor) optimiert, sie sind frei von organischen Verunreinigungen. Das Ziel dabei ist es, dass insbesondere bei Gradientenmethoden gegen Ende des Gradientenlaufs keine Geisterpeaks auftauchen. LC-MS grade ist frei von ionischen Verunreinigungen, da ja jene ein verstärktes Rauschen verursachen würden. Ferner würde ihre Ionisierung zum Empfindlichkeitsverlust führen. Organische Verunreinigungen können hier zwar zugegen sein, die...
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6. Juli 2019
ApparaturB OptimierungChromatogrammGradientHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferPeakverbreiterungTotvolumenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die...
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1. Juni 2019
A FehlersucheApparaturEinstellparameterHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVeränderung des Chromatogramms

Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)...
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3. Mai 2019
A FehlersucheACNApparaturAuto-SamplerDetektorGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsProbengeber

HPLC im Frühjahr… 

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche...
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2. April 2019
ApparaturB OptimierungBodenzahlEinstellparameterGradientHPLC-TippsInjektionsvolumenOptimierungProbenlösungsmittelTotvolumen

Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun...
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1. März 2019