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Trends in der HPLC

Von Allgemein, Detektor, Eluent, Jahrestipps, LC-MS-Kopplung, Optimierung

Trends in der HPLC Stavros Kromidas Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt. Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss. Highlight: Mehrdimensionale Trennungen Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken. Begründung: Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information…

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Wann ist eine „gute“ Peakform besonders wichtig?

Von Allgemein, Jahrestipps

Der Fall Vereinfacht gesagt, ist die Trennleistung – Effizienz, „Performance“, als Bodenzahl wiedergegeben – ein Maß für die Peakform. Eine große Bodenzahl bedeutet scharfe, symmetrische Peaks, eine geringe Bodenzahl dagegen breite, evtl. tailende Peaks. Warum ist die Peakform bei der Trennung großer Moleküle, z. B. Biomoleküle, besonders wichtig oder kritisch? Die Lösung Zunächst gilt es drei Punkte festzuhalten: In der Chromatographie ist die Auflösung (Resolution, R), also der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie, das wahrscheinlich aussagekräftigste Kriterium für die Güte einer Trennung Die Auflösung ist abhängig von der Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Maß: Retentionsfaktor k), von der Selektivität (unterschiedlich starke Wechselwirkungen zweier Substanzen, Maß: Trennfaktor α) und von der Trennleistung (Peakform, Maß: Bodenzahl, N) Ein wichtiger Trennmechanismus bei Biomolekülen (z. B. Proteine, monoklonale Antikörper) ist die Ausschlusschromatographie, SEC In der SEC basiert die Trennung auf unterschiedliche Molekülgrößen, eine Wechselwirkung findet definitionsgemäß gar nicht statt (sollte …). Somit entfallen bzgl. Auflösung hier zwei der drei möglichen Optimierungsparameter, nämlich  Kapazität und Selektivität. Das bedeutet: Man kann in der SEC eine genügend gute Trennung nur über eine Verbesserung der Trennleistung, d.h. über die Peakform erzielen. Somit konzentrieren sich die Bemühungen bei der Optimierung einer SEC-Methode erstens auf die Unterbindung von Wechselwirkungen…

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Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Jahrestipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen, zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023. Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.   Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches Symptom noch? Kommentar ∆ A + ∆ H 1. ∆ Injektionsvolumen 2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt) 3. ∆ Detektor 4. Instabile Probe 5. ∆ pH-Wert 6. ∆ Probekonzentration                 5. ∆ Peakform 1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit 2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen) 3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle 5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen 6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe) ∆ H + ∆ tR, A = konstant 1. Eluent 2. ∆ stationäre Phase 3. ∆ Temperatur 1. ∆ P     3. ∆ P Stets: t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch ∆ Peakform…

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Die „Kleinen“ im Sommer …

Von Allgemein, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Probenlösungsmittel

1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn 2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen   „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX) Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B….

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Peaky und Chromy beim Denksport

Von Allgemein, HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung: „Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“ „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern. „Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen…

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Peaky & Chromy beim Denksport

Von Allgemein, HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky ist wegen der doch sehr lange anhaltenden Pandemie und dem speziellen Jahresstart immer noch richtig „aufgekratzt“, er lässt den armen, gemütlichen Chromy – nach einem schnellen, obligatorischen „Ein gutes, neues Jahr 2022“ – einfach nicht in Ruhe. Chromy bleibt nichts anderes übrig als auf ihn einzugehen, er kann ja später mit den C18-Borsten weiter flirten. Peaky: Du Chromy, wir wollen etwas spielen, OK? Und weil Du sooo gescheit bist, sollst Du Dich etwas anstrengen. Also: Ich präsentiere Dir Antworten und Du sollst Dir eine vernünftige, passende Frage überlegen. Und hör mal: Ich habe nicht so viel Zeit, die Silanole…

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HPLC und Politik? Aber ja doch …

Von Allgemein, HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

HPLC ist ein flexibles, leistungsfähiges Tool und findet vielfach Verwendung, man/frau denkt gar nicht wo überall. HPLC und Politik? Aber ja doch … Viele von uns betreiben HPLC (High Pleasure Liquid Chromatography). Wichtige Dinge finden nun – manchmal – Einzug in die Politik. So auch die HPLC mit ihren Varianten. Ob allerdings das Prinzip der HPLC von allen PolitikerInnen richtig verinnerlicht wurde? Ich weiß nicht so recht … Wichtige HPLC-Modi in der Politik Einige betrieben HPLC lange Zeit mehr schlecht wie recht (Huge Problems, Little Creativity), jetzt sind sie lediglich Verwalter (Happy Professionals Lame Champions). Bei einigen Neulingen habe ich…

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Unruhige Basislinie – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Allgemein, Apparatur, Detektor, Dichtungen, HPLC-Tipps

Der Fall Starkes Rauschen der Basislinie hat hauptsächlich zwei Ursachen: Entweder sind es Flussschwankungen oder es handelt sich um elektronisches bzw. optisches Rauschen. Wie kann man die zwei Ursachen unterscheiden? Die Lösung In Abbildung 1 und 2 sind typische Beispiele von diversen „unschönen“ Basislinien. Es handelt sich dabei um eigene Messungen und um Beispiele von Günther Eppert, die mit Genehmigung gezeigt werden. Faustregel: Periodisches, mehr oder weniger regelmäßiges Rauschen deutet auf Probleme mit der Pumpe hin, das wäre „Mechanik“. Hochfrequentes, „unruhiges“ Rauschen deutet auf Elektronik bzw. Optik hin. Abbildung 1 Pumpe Abb. 1 Oberes und mittleres Bild: Flussschwankungen aufgrund von…

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Automatische oder Vollpipetten?

Von Allgemein, HPLC-Tipps

Der Fall Die Vorteile der automatischen Pipetten liegen auf der Hand. Der herausragende dürfte die hervorragende Reproduzierbarkeit in der Routine sein. Wie ist es nun um die Richtigkeit im Falle von starken Verdünnungen bestellt? Die Lösung Im Rahmen eines Projektes musste eine Probe mit zwei recht unterschiedlichen Analyten stark verdünnt werden. Eine wichtige Frage war dabei, ob sich bei starken Verdünnungen ein systematischer Fehler erkenne lässt, ob also die Richtigkeit hier gegeben ist. Dabei haben wir neben diversen Parametern wie Lösungsmittel, Material der Gefäße etc. auch Autopipetten im Vergleich zu Vollpipetten getestet. Es versteht sich von selbst, dass beim letztgenannten…

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Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Von Allgemein, Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung des Chromatogramms

Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):           Katalytische Wirkung des Kieselgels Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit…

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