Kategorie

Allgemein

Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Monatstipp, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen,

zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.

Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.

In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.

 

Änderung (Symptom)Ursache(n)Welches Symptom noch?Kommentar
∆ A + ∆ H1. ∆ Injektionsvolumen

2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt)
3. ∆ Detektor

4. Instabile Probe

5. ∆ pH-Wert

6. ∆ Probekonzentration

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ∆ Peakform

1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit
2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen)
3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle
5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen
6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR,
A = konstant
1. Eluent
2. ∆ stationäre Phase
3. ∆ Temperatur
1. ∆ P

 

 

3. ∆ P

Stets:
t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel
auch
∆ Peakform

1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H,
A = konstant
∆ PackungsqualitättR = konstant,

Verschlechterung der Peakform

∆ tR, ∆ t0, ∆ A,
H = fast konstant
∆ Fluss∆ P Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform –
alle Peaks
 

1. Totvolumen
2. Verschlechterung der Packungsqualität

 

tR = konstant

Schlechte Peakform –
einige Peaks
∆ pH-WertBetroffene Peaks: ∆ tREtwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks1. Hohlraum im Packungsbeet
2. Verbogene Injektionsnadel
3. Substanz liegt in zwei Formen vor
 

 

3. pH-Wert minimal verändern

 

 

Die „Kleinen“ im Sommer …

Von Allgemein, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Jahrestipps, Probenlösungsmittel

1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn 2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen   „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX) Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B. 70/30 Iso-OH/Wasser) ist zum Entfernen von Mikroorganismen effektiver als beispielsweise eine starke, z. B. eine 90 oder 100 % Iso-OH-Lösung. So auch mit Wasserstoffperoxid: Eine 3 % ige H2O2-Lösung ist effektiver als z. B. eine 10 % -ige Substanzen bleiben aus schwach-konzentrierten Probelösungeneher als aus stärker-konzentrierten durch Adhäsion oder Physisorption an allerlei Oberflächen „hängen“ (Memory-Effekt)        2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen Vorbemerkung: Der Einfachheit halber unterstellen wir hier einen isokratischen Lauf, die Aussagen gelten jedoch grundsätzlich auch für Gradientenläufe. Folgender fiktiver Fall: Die Effizienz Ihrer Säule beträgt 10.000 Böden, bei den aktuellen chromatographischen Bedingungen…

Weiterlesen

Peaky und Chromy beim Denksport

Von Allgemein, Jahrestipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung: „Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“ „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern. „Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen Peak liefert?“ „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“ Schlechte Packungsqualität und Totvolumen sind Substanz-unspezifische Problemquellen. Liegt eine solche vor, so ergibt sich stets – unabhängig von der Natur der injizierten Komponente – eine schlechte Peakform. „Warum müssen die Substanzen in dieser Probe stark polar sein?“ „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“Wenn trotz geringer Konkurrenz um die Gunst der C18-Borsten seitens der Moleküle in der…

Weiterlesen

Peaky & Chromy beim Denksport

Von Allgemein, Jahrestipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky ist wegen der doch sehr lange anhaltenden Pandemie und dem speziellen Jahresstart immer noch richtig „aufgekratzt“, er lässt den armen, gemütlichen Chromy – nach einem schnellen, obligatorischen „Ein gutes, neues Jahr 2022“ – einfach nicht in Ruhe. Chromy bleibt nichts anderes übrig als auf ihn einzugehen, er kann ja später mit den C18-Borsten weiter flirten. Peaky: Du Chromy, wir wollen etwas spielen, OK? Und weil Du sooo gescheit bist, sollst Du Dich etwas anstrengen. Also: Ich präsentiere Dir Antworten und Du sollst Dir eine vernünftige, passende Frage überlegen. Und hör mal: Ich habe nicht so viel Zeit, die Silanole warten schon auf mich, also denk´ ratzfatz. Er setzte sein schelmisches Lächeln auf und legte los: „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“ „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“ „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“ „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“ „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate…

Weiterlesen

HPLC und Politik? Aber ja doch …

Von Allgemein, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

HPLC ist ein flexibles, leistungsfähiges Tool und findet vielfach Verwendung, man/frau denkt gar nicht wo überall. HPLC und Politik? Aber ja doch … Viele von uns betreiben HPLC (High Pleasure Liquid Chromatography). Wichtige Dinge finden nun – manchmal – Einzug in die Politik. So auch die HPLC mit ihren Varianten. Ob allerdings das Prinzip der HPLC von allen PolitikerInnen richtig verinnerlicht wurde? Ich weiß nicht so recht … Wichtige HPLC-Modi in der Politik Einige betrieben HPLC lange Zeit mehr schlecht wie recht (Huge Problems, Little Creativity), jetzt sind sie lediglich Verwalter (Happy Professionals Lame Champions). Bei einigen Neulingen habe ich meine Bedenken ob hinter glänzenden, inerten Oberflächen auch gute Spezifikationen schlummern (High Potential Low Charge). Einige PolitikerInnen wiederum sind auf der Höhe der Zeit und bringen die Umwelt-Diskussion forsch voran (High Promises for Low Carb). Diversität der HPLC und Ziele Schwierige, seltene Trennprobleme in der Analytik bedürfen bekanntlich speziellen Säulen (Porous Layer Open Tube Columns). Fehlt jedoch das entsprechende Know How, ist das Ergebnis in Analytik und Politik ernüchternd (Problems, Little Output, Total Chaos). Wirklich schwierige Fälle sind allerdings eher selten, das (HPLC)Volk interessiert sich alltäglich für klassische UHPLC-Themen (Umweltverschmutzung, Heizung, Preise, Lieferketten, Coronabekämpfung). Und in der Politik? Klassisch-attraktive UHPLC-Schwerpunkte…

Weiterlesen

Unruhige Basislinie – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Allgemein, Apparatur, Detektor, Dichtungen

Der Fall Starkes Rauschen der Basislinie hat hauptsächlich zwei Ursachen: Entweder sind es Flussschwankungen oder es handelt sich um elektronisches bzw. optisches Rauschen. Wie kann man die zwei Ursachen unterscheiden? Die Lösung In Abbildung 1 und 2 sind typische Beispiele von diversen „unschönen“ Basislinien. Es handelt sich dabei um eigene Messungen und um Beispiele von Günther Eppert, die mit Genehmigung gezeigt werden. Faustregel: Periodisches, mehr oder weniger regelmäßiges Rauschen deutet auf Probleme mit der Pumpe hin, das wäre „Mechanik“. Hochfrequentes, „unruhiges“ Rauschen deutet auf Elektronik bzw. Optik hin. Abbildung 1 Pumpe Abb. 1 Oberes und mittleres Bild: Flussschwankungen aufgrund von Luft in der Pumpe Unteres Bild: Defekte Kolbendichtung Abbildung 2 Detektor Abb. 2 Oberes Bild: Minimale Druckschwankungen im Bereich von ca. 0,1 bar wie hier führen zur Bildung von Schlieren, die vom UV-Detektor registriert werden und zu einem hochfrequenten Rauschen führen Mittleres Bild: Belag auf dem Fenster eines UV-Detektors Unteres Bild: Defekte Deuteriumlampe Das Fazit Beim periodischen, gleichmäßigen Rauschen ungefähr gleichbleibender Amplitude denke an die Pumpe: Dichtung, Leck, Luft. Beim hochfrequenten, unruhigen Rauschen denke an Elektronik bzw. Optik: Schwache Lampe, Haarriss am Detektor, Belag in der Zelle, verschmutztes MS-Interface, Spülautomat (oder sonstiges …) in unmittelbarer Nähe zu einer HPLC-Anlage mit…

Weiterlesen

Automatische oder Vollpipetten?

Von Allgemein

Der Fall Die Vorteile der automatischen Pipetten liegen auf der Hand. Der herausragende dürfte die hervorragende Reproduzierbarkeit in der Routine sein. Wie ist es nun um die Richtigkeit im Falle von starken Verdünnungen bestellt? Die Lösung Im Rahmen eines Projektes musste eine Probe mit zwei recht unterschiedlichen Analyten stark verdünnt werden. Eine wichtige Frage war dabei, ob sich bei starken Verdünnungen ein systematischer Fehler erkenne lässt, ob also die Richtigkeit hier gegeben ist. Dabei haben wir neben diversen Parametern wie Lösungsmittel, Material der Gefäße etc. auch Autopipetten im Vergleich zu Vollpipetten getestet. Es versteht sich von selbst, dass beim letztgenannten Test restliche Parameter wie Inertheit der Glasoberfläche, Temperatur usw. konstant gehalten wurden. Die Ergebnisse: Es zeigte sich, dass bis zu einem Verdünnungsfaktor von sechs bei beiden Pipetten keine nennenswerten systematischen Fehler festzustellen waren. Dies änderte sich jedoch bei einer weiteren Verdünnung schlagartig, siehe dazu Abbildung 1 und 2: Auch bei einer Verdünnung um Faktor 8 bleibt die Abweichung vom Sollwert bei den Vollpipetten im Bereich von ca. 2 %. Bei den automatischen Pipetten jedoch beträgt diese ca. 9 % bzw. ca. 16 %, siehe Abbildung 1. Dies entspricht einem tatsächlich gefundenen Wert von lediglich ca. 92 % bzw. ca. 85…

Weiterlesen

Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Von Allgemein, Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Methodentransfer, Monatstipp, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung des Chromatogramms

Geisterpeaks – aber erst „später“
Verbesserung der Empfindlichkeit

Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen

Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):

          Katalytische Wirkung des Kieselgels

  • Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit spät eluieren. Sind solche Substanzen in der Probe enthalten, so erscheinen evtl. Geisterpeaks. Fehlen diese Komponenten, eluieren nur Komponenten, die schwache Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen, die Geisterpeaks fehlen

    Verstärkt Hydrolyse durch ungewollte Veränderung chromatographischer Parameter
  • Stellen wir uns eine lange Sequenz vor: bei den gegen Ende der Sequenz zu injizierenden Proben herrscht im vial evtl. eine andere Temperatur als bei den Proben davor (z. B. Temperaturdifferenz Kühlschrank-Probengeber oder Temperaturgradient im Probenraum des Probengebers)
  • Auch folgendes wäre im Falle einer langen Sequenz denkbar: der pH-Wert im vial ändert sich mit der Zeit – aus welchen Gründen auch immer – und ab einem bestimmten pH-Wert sind allerlei Veränderungen der Probe denkbar und somit erscheinen zusätzliche Substanzen erst nach einer gewissen Zeit

    Oxidationsprodukte
  • Man/frau arbeitet mit Tetrahydrofuran (THF) in der mobilen Phase; ein Blindgradient zu Beginn zeigt keine Probleme. Mögliche Peroxide aus dem THF sammeln sich allerdings erst mit der Zeit an der Säule und erscheinen nach einer Zeit X als Geisterpeaks gegen Ende des Gradienten. Man/frau wundert sich wieso erst nach so und so vielen Stunden bei den Nachtläufen Geisterpeaks auftauchen…
  • Trotz sicherlich Endreinigung der Dichtungen vor Auslieferung, kann eine Rest-Fettschicht auf deren Oberfläche vorhanden sein. Deren Oxidationsprodukten (z. B. N-Oxide) können als Geisterpeaks erscheinen, die Anzahl und der Zeitpunkt kann von der Arbeitsweise abhängig sein: Anzahl der Läufe, Temperatur, Eluent, Zusammensetzung der mobilen Phase bei der Lagerung usw.Auffüllen des Vorratsgefäßes
  • In Acetonitril können Polymere entstehen. Wird das Vorratsgefäß stets aufgefüllt sobald ca. die Hälfte des Lösungsmittels aufgebraucht ist, gibt es keine Probleme, deren Konzentration ist gering. Erfolgt das Auffüllen nicht immer zum gleichen Zeitpunkt, kann passieren, dass bei geringer Flüssigkeitsmenge im Vorratsgefäß die Polymer-Konzentration derart hoch ist, dass neben „Wellen“ in der Basislinie auch Geisterpeaks erscheinen. Also frei nach Giovanni Trapattoni: „Flasche voll: Keine Probleme, Flasche (fast) leer: Probleme

Verbesserung der Empfindlichkeit

Über das Thema haben wir uns an dieser Stelle bereits mehrfach unterhalten. Da es wichtig ist, möchte ich weiter unten die aus meiner Sicht effektivsten Maßnahmen verdichtet zusammenfassen. Das Ziel lautet: Möglichst große, schmale, symmetrische Peaks.

  1. Optimale Bedingungen bezüglich Hard- und Software:
  • *Geringes Dispersionsvolumen (vereinfacht: Totvolumen)
  •   Notwendig bei bestimmten Analyten: Inerte/Bio-inerte/Metall-freie Anlage und inerte bzw. Peek-ummantelte Säule,    silanisierte vials
  • *Falls möglich, mit Luftsegmenten zwischen Probengeber und Säule arbeiten, um eine Verdünnung der Substanzzone
    zu verhindern
  • *Optimale Settings, z. B. mindestens 40 Datenpunkte, 16 nm Spalt, 50 ms Zeitkonstante, Rauschen-Unterdrückung
  •   Je nach verwendeter Detektionsart und Analyt-Stabilität das technisch maximal Machbare nutzen, z. B: Max-
    Light/LightPipe (UV), Triple Quad MS (LC-MS), ICP-MS
  1. Chromatographische Parameter:
  • Nach Möglichkeit kurze, in jedem Fall dünne Säulen; wenn die Voraussetzungen gegeben sind, evtl. auch an Kapillaren denken
  • Core Shell- (1,3-1,7 µm) oder falls es porös sein muss, Sub2µm-Material
  • *Stets schwächeres Probelösungsmittel im Vergleich zum Anfangsgradienten verwenden: Anreicherung der
    Substanzzone am Säulenkopf; ggf. mit Hilfe eines Schaltventils Anreicherung in einer Trap-Säule in Erwägung ziehen
  • *Steiler Gradient mit 30-40 % B beginnend
  • *Bei thermostabilen Komponenten tendenziell bei höheren Temperaturen chromatographieren

Die mit „*“ versehenen Maßnahmen sind relativ schnell umzusetzen, der Rest ist mit einem gewissen Aufwand verbunden, der Nutzen kann nur individuell bewertet werden.