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Chromatogramm

Ultraschallbad und Peakfläche

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, Wasser

Der Fall Das Ultraschallbad wird häufig auch zum Auflösen von Proben verwendet. Sein Einfluss auf die späteren chromatographischen Ergebnisse sollte nicht unterschätzt werden. Im Falle von schwankenden Peakflächen sollte ggf. an mögliche Variabilitäten im Zusammenhang mit dem Ultraschallbad gedacht werden. Die Lösung Es existieren verschiedene Einflussfaktoren, von denen hier einige aufgeführt sind:           Verteilung der Energie/Temperatur Welches Wasser wird verwendet, Leitungs- oder destilliertes Wasser? Wie ist der Wasserstand? Bei hohem Wasserstand: Geringe Energie, dafür jedoch homogen verteilt. Niedriger Wasserstand: Erhöhte Energie, dadurch effektiveres Auflösevermögen. Durch die höhere Temperatur besteht allerdings eine größere Gefahr von Hydrolyse, Umlagerung oder generell einer Veränderung von Komponenten in der Probe/Matrix. Dies wird beispielsweise bei bestimmten Wirkstoffen (z. B. Paracetamol), Vitaminen, Aminosäuren und Farbstoffen beobachtet. Wie ist die Größe und Geometrie der U-Bades, rund vs. eckig, Dicke der Wände etc. ? Wie ist die Größe, Geometrie und Material des Gefäßes in dem die vials/Probekölbchen sich befinden, z. Becherglas vs. Drahtgestell. Beim Drahtgestell: Maschenweite 10 oder 15 mm? Steht das Ultraschallbad direkt auf dem Labortisch oder auf einer Gummimatte/auf Gummifüßchen? Positionierung der vials/der Probekölbchen; befindet sich z. B. das Kölbchen direkt auf dem Boden oder in einer Höhe von 5 oder 20 cm?…

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Die Kleinen im Sommer: Säurezusatz im Eluenten, Gefahr für Niederschläge, Vorsäule ja, aber was für eine?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Eluent, HPLC-Tipps Demo, Uncategorized, Vorsäule

 

  • Säurezusatz im Eluenten
  • Gefahr für Niederschläge
  • Vorsäule ja, aber was für eine?

Alternativen zu TFA

Trifluoressigsäure (TFA) wird gerne zum Ansäuern in der RP-HPLC verwendet, häufig bei – eventuell erst in der Zukunft geplanten –  LC-MS-Kopplungen. TFA bereitet jedoch bekanntlich einige Probleme, so in etwa Basisliniendrift, immer wieder Empfindlichkeitsverlust, TFA kann lange auf der Säule bleiben usw. Welche Alternativen hätten wir? Wenn Ameisensäure für bestimmte Trennungen nicht sauer genug ist, könnte man an Pikrin- oder an Sulfamin- oder an Difluoressigsäure (DFA) denken. Ferner – sollte ein Ionenpaarreagenz benötigt werden – an Methansulfonsäure. Noch ein Wort zu Phosphatpuffer: Phosphorsäure bzw. ein Phosphatpuffer bewährt sich seit langem in der RP-HPLC mit UV-Detektion. Sollten Sie mit der Trennung bzgl. Selektivität/Peakform bei Anwendung von Phosphorsäure oder Phosphatpuffer zufrieden sein, könnte man getrost eine LC-MS-Trennung wagen: Bei einer Verwendung von ca. 10 mM Phosphatpuffer müsste man erst nach 4-5 Stunden das Interface reinigen. Merke in diesem Zusammenhang folgende generelle Regel: Je ähnlicher der pH-Wert des Eluenten zum pKS-Wert des verwendeten Puffers ist, desto niedriger kann die notwendige Pufferkonzentration sein. Dennoch gilt: Das Dilemma gutes chromatographisches Ergebnis vs. Reinigungs-Aufwand kann nur individuell gelöst werden.

Niederschlag

Eine Verstopfung im Gerät durch einen Niederschlag ist immer ärgerlich. Es liegt auf der Hand, dass diese Gefahr mit steigender Puffer- und Acetonitril-Konzentration sowie bei niedrigen Temperaturen zunimmt. Nachfolgend einige Hinweise:

  • Ab ca. 85% Acetonitril in der mobilen Phase und ≥ ca. 20 mM Puffer nimmt das Risiko von Niederschlag im Falle von dünnen, ≤ ca. 0,13 mm Kapillaren stark zu
  • „Phosphatpuffer“ – nur welcher? K2HPO4 (Pufferbereich: pH-Wert = 6,5-7,5) macht kaum Probleme, die Löslichkeit ist sehr gut. Na2HPO4 dagegen, insbesondere bei hohem ACN-Anteil und ≤ ca. 25 °C, kann definitiv Probleme bereiten, denn: Die Differenz der Löslichkeit der zwei Salze beträgt mehr als Faktor 20! Im sauren gibt es generell kaum Schwierigkeiten
  • Ammoniumacetat bei ≥ ca. 60% ACN: Farblose Kristalle, die beispielsweise in der Mischkammer ausfallen

Die „geeignete“ Vorsäule

Oft wird eine Vorsäule zum Schutz der Hauptsäule eingesetzt. Das Material der Vorsäule muss nicht unbedingt identisch mit dem der Trennsäule sein, es ist Regel-konform, wenn es z. B. auch „C18“ ist. Warum nicht identisch? Die Vorsäule hat in der Regel die Aufgabe, ziemlich „viel“ von der störenden Matrix zu adsorbieren, dabei soll sie nach Möglichkeit wenig Druck aufbauen. Diese Anforderungen führen zu folgenden sinnvollen Charakteristika für eine Vorsäule:

  • Gute Beladbarkeit: Dazu soll das Material der Vorsäule eine möglichst große spezifische Oberfläche aufweisen, z. B ≥ 250 m2/g
  • Große Bindungskapazität: Die Beladungsdichte des Materials sollte über 3 mMol/m2 der Kohlenstoffgehalt über ca. 18-20% C betragen
  • Im Falle von Gradiententrennungen spielt die Teilchengröße eine untergeordnete Rolle. Somit kann die Teilchengröße in der Vorsäule ruhig 5 µm betragen, auch dann, wenn die analytische Säule 3 µm-Teilchen oder kleiner enthält. 5 µm- Teilchen sind haltbarer als 3 µm und bauen einen geringeren Druck auf.

Wird eine Vorsäule nicht zum Schutz der Hauptsäule, sondern zu einer Verbesserung der Trennung von sehr polaren Komponenten – also Elution solcher um oder kurz nach der Totzeit – eingesetzt, sollte das Material natürlich polarer als jenes der Hauptsäule sein. Im Falle einer C18-Hauptsäule kämen somit folgende Phasen für die Vorsäule in Frage:
CN, Phenyl-Hexyl, PFP, Hypercarb, Kieselgel oder Mixed-Mode.

Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Von Apparatur, B Optimierung, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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Trennung von polaren Analyten in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Ihre Peaks, die ab ca. der 3-fachen Totzeit eluieren (also ab einem Retentionsfaktor von k = 3, was genügend starke Wechselwirkungen bedeutet), werden ordentlich getrennt. Kopfzerbrechen bereiten Ihnen eher die polaren Komponenten, die direkt nach der Totzeit eluieren – ihre Trennung sei dürftig. Verständlicherweise möchten Sie ungerne gleich die gesamte Methode verändern. Was wäre nun zu tun? Die Lösung Für die Verbesserung der Trennung von polaren Komponenten in der RP-HPLC könnte man sich einen 3-Stufen-Plan mit zunehmendem Aufwand vorstellen: Einfache Maßnahmen – Manipulation (im positiven Sinne!) der Probelösung – Probelösung polarer machen, um eine „On…

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Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen (2)

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Ca. 70-80% der RP-Trennungen in der Routine sind Gradientenläufe. Den meisten Anwendern sind die Vorteile der Gradientelution geläufig, so z. B: Trennung von polaren und apolaren Komponenten in einem Lauf, merklich kürzere Trenndauer im Vergleich zu isokratischen Läufen, Erniedrigung der Bestimmungsgrenze und nicht zuletzt: Ein Übersichtsgradient ist ein hervorragender erster Schritt bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe. Was ist nun bei Gradiententrennungen grundsätzlich „anders“ im Vergleich zu isokratischen Trennungen? Die Lösung Isokratische und Gradiententrennungen stellen zwar keine gänzlich andere Welten dar, gibt es doch einige entscheidende Unterschiede. Nachfolgend greife ich stellvertretend zwei Unterschiede heraus. Interessierten Lesern sei auf…

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Peaks auf einer Flanke – mögliche Konsequenzen und Maßnahmen

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Manch´ ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren? Die Lösung Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Hier möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen. Fall 1 In Abb. 1 sind sechs…

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Fluss, Peakhöhe und Peakfläche

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Detektor, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wenn der Fluss sich ändert, ändert sich auch die Peakform – mal stärker, mal schwächer. So weit so gut. Was machen nun die Peakhöhe und die Peakfläche? Ändern sie sich ebenso und wenn ja, ist dies merklich? Was wären schließlich die Konsequenzen? Die Lösung Es muss grundsätzlich zwischen Konzentrations- und Massen-empfindlichen Detektoren unterschieden werden: Der UV- (UV-Vis, DAD) und der Fluoreszenzdetektor beispielsweise sind Konzentrations-empfindliche Detektoren, der Massendetektor bei der LC/MS- bzw. LC/MS/MS-Kopplung ein Massen-empfindlicher Detektor. D.h. im ersten Fall ist das Signal von der Konzentration, im Zweiten von der Masse der Analyten abhängig. Bei einem Konzentrations-empfindlichen Detektor verändert…

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Die Auflösung – verschiedene Formeln, verschiedene Ergebnisse

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps

Der Fall Die Auflösung ist – vereinfacht gesagt – der Abstand zwischen zweier Peaks an der Basislinie. Sie hängt von der absoluten Stärke der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Kapazität, Retentionsfaktor k), von dem Verhältnis der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Selektivität, Selektivitäts- oder Trennfaktor α) und von der Peakform (Effizienz, Bodenzahl N) ab. Die Auflösung wird als das wichtigste Kriterium für die „Güte“ einer Trennung angesehen. So wird oft eine Mindestauflösung verlangt, auch werden Auflösungen zum Methodenvergleich heran gezogen. Es ist nun so, dass es mehrere Formeln für die Auflösung gibt, die alle mehr oder weniger benutzt werden. Es liegt somit auf…

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