Der Fall Die Injektionsreproduzierbarkeit bei kleinen Injektionsvolumina um die 1-2 µl (oder noch kleiner) stellt bei modernen Geräten heute zunächst keine besondere apparative Herausforderung dar. Falls dennoch in einem aktuellen Fall die Injektionsreproduzierbarkeit zu wünschen übriglässt: Wie sollte verfahren werden? Die Lösung Vorbemerkung: Es versteht sich von selbst, dass für die nachfolgend beschriebene Tests reale Proben injiziert werden sollten; Injektionen von Standardlösungen zeitigen lediglich die Reproduzierbarkeit des Autosamplers für betreffendes Injektionsvolumen. Nicht jedoch, ob „hier und jetzt“ diese Methode an diesem Gerät gemäß den Anforderungen funktioniert. Injektionen von Standardlösungen sind nur dann statthaft, wenn im Rahmen der Validierung belegt worden ist, dass die Probematrix das Ergebnis nicht (signifikant) beeinflusst. Als erstes würde ich das Injektionsvolumen wie in der Methode angegeben sowie das 2-, 3-, 4-fache davon injizieren. Wird die Peakfläche um das 2-, 3-, 4-fache erhöht? Wenn ja wissen Sie, dass in diesem niedrigen Konzentrationsbereich die Linearität gegeben ist. Als nächstes käme ein weiterer, etwas aufwendiger Test, die Notwendigkeit kann nur individuell bejaht werden: Jedes der vier Injektionsvolumina wird 5-mal injiziert und der Variationskoeffizient ermittelt. Der jeweils sich ergebende Variationskoeffizient zeigt Ihnen „schwarz auf weiß“, welche Präzision für welches Injektionsvolumen bei dieser Probe und diesen chromatographischen Bedingungen zu erwarten ist….
Der Fall Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage? Die Lösung Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind. Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen: Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem…
In diesem HPLC-Tipp geht es um diverse Probleme, die mit den Autosampler-Vials zu tun haben.
Vials, immer wieder vials…
Beim Schütteln eines vials (bei mir leider immer wieder eine spontane Bewegung…) kann sich auf der Unterseite des vial-caps ein Substanzfilm bilden – die Reproduzierbarkeit der Injektion lässt zu wünschen übrig. Beim Vortexieren bzw. automatischen Schütteln ist diese Gefahr eher selten gegeben, die Präzision bei Wiederholinjektionen ist in der Regel besser
Der Greifarm des Autosamplers hat evtl. ein vial verloren; wenn man Pech hat, versteckt sich jenes unter dem Karussell. Dadurch ist das Karussell nun etwas schief, die vials dort liegen ein wenig niedriger/höher, Ergebnis: Geänderte Peakflächen. Der Grund: Die Nadel stößt evtl. an den Wänden vom vial an oder sie kommt auf dem Boden auf. Oder aber im Falle von inhomogenen Probelösungen ergibt sich eine unterschiedliche Probekonzentration oder sogar ein Konzentrationsgradient . Und je nachdem, aus welcher Höhe die Nadel Probelösung ansaugt, ergeben sich Schwankungen der Peakfläche oder ein Trend dergleichen. Die Höhe eines vials kann sich auch dann verändern, wenn sich unter dem vial Schmutz, Dichtungsabrieb, Salzkriställchen usw. eingefunden haben
Hellrote vs. dunkelrote vs. Silikon vs. vorgeschlitzte vs. „Sandwitch-Septen“; Unterschiede bezüglich Abriebs bzw. Verdampfens von Probelösungsmittel bzw. Neigung zu Memoryeffekt
Vial richtig dicht vs. einfach „klack“ und somit eher locker aufgesetzt: Im ersten Fall ist die erste Injektion evtl. fehlerbehaftet (durch den Unterdruck beim erstmaligen Stechen der Nadel drückt sich etwas von der Probelösung in die Nadel hoch) im zweiten Fall sind alle Injektionen OK – auch die erste
Vial, beispielsweise Nr. 18, geht immer wieder kaputt; das ist zwar ein seltener Fall, dennoch möchte ich ihn erwähnen: Durch einen Fabrikationsfehler kann beim 6-Port-Ventil passieren, dass die zwei Scheiben nicht 100% übereinander liegen. Bei wiederholten Problemen mit Injektionen nur aus einem bestimmten vial am besten zeitnah den Hersteller wegen eines Austausches kontaktieren
Probleme beim Methodentransfer
Beim Methodentransfer tauchen oft deswegen Probleme auf, weil nicht alle Informationen ausgetauscht bzw. Begriffe unterschiedlich verstanden werden. Nachfolgend drei Beispiele betreffend die vials:
„Wir arbeiten bei diesen geringen Volumina mit Aufsätzen, die sollt ihr auch verwenden“. „OK“. Nur: In einem Labor werden die beweglichen (und billigen) Aufsätze verwendet, im anderen die festen Aufsätze. Es ergeben sich womöglich unterschiedliche Peakflächen, weil im ersten Fall die Nadel links oder rechts die Vial-Wand berühren kann…
„Wirkstoff X bleibt gerne hängen, ihr sollt vials mit inerter Oberfläche verwenden.“ „OK“. Nur: Versteht jede(r) unter „inert“ das Gleiche?
Es werden statt Glas, PP-vials verwendet; die einen haben die normalen Eppi´s die anderen die low-bind Eppi´s …
Die vials werden mit HCL behandelt; die Silanolgruppen auf der Glasoberfläche liegen undissoziiert vor, basische Wirkstoffe werden zwar nicht adsorbiert, Wasserstoffbrückenbindungen wären jedoch möglich
Es werden silanisierte vials verwendet; analog einer endcappeden C18-Phase werden nicht nur keine basische sondern überhaupt keine polare Komponenten adsorbiert
Es werden silikonisierte vials verwendet; durch die Silikon-Schutzschicht wird nicht lediglich Adsorption sondern auch eine Benetzung der Oberfläche verhindert, die Probelösung perlt einfach ab
„Wir arbeiten mit vials mit so ´ne Verjüngung, weißt Du? „Ja, wir auch!“ Nur: Erstens, können solche Aufsätze unterschiedliche Länge aufweisen. Und zweitens kann der Durchmesser am Ende der Verjüngung unterschiedlich groß sein. Dadurch kann durch die Oberflächenspannung genau dort ein Luftbläschen entstehen – und dies abhängig vom Probelösungsmittel! Ergebnis: Unterschiedliche Peakflächen
In Abbildung 1 werden Aufsätze der Firma VWR gezeigt, die die hier erwähnten Unterschiede demonstrieren.
Abbildung 1: Aufsätze für HPLC-vials unterschiedlicher Länge und unterschiedlicher Verjüngung, Details, siehe Text
Schauen wir uns die in diesem Tipp beschriebenen Fälle an: Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (II)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter? Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor 1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In…
Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (I)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter? Betätigen wir uns gerade ein wenig „sportlich“ und betrachten nun folgende Situationen: Jeder von uns macht in seinem (HPLC-) Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen –…
Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…
Ein paar Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen Änderung der Peakform und der Peakfläche durch ungewollte Änderung des pH-Wertes Wiederfindung abhängig von der (Glas)Oberfläche In diesem Tipp haben wir bereits einige Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen besprochen, auch hier wurde das Thema behandelt. Nun, weiter unten einige Weitere: Retentionszeit bei isokratischen Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Abnahme der Retentionszeit um Faktor 2 Retentionszeit bei Gradienten-Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Natürlich ebenso Abnahme der Retentionszeit, allerdings abhängig von mehreren Faktoren lediglich um ca. 10-30% Und überhaupt: Die Retentionszeit wird bei Gradientenläufen vom Start- und End % B sowie von…
Der Fall Ist die Probelösung nicht identisch mit der mobilen Phase (bzw. mit der Anfangszusammensetzung vom Eluent A bei der Gradientelution) kann dies einen Einfluss auf das Chromatogramm haben. Wie macht sich das nun genau bemerkbar? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: „Andere“ Probelösung kann vielerlei bedeuten: Andere Zusammensetzung, anderes organisches Lösungsmittel, anderer pH-Wert, andere Pufferstärke/anderes Salz etc. Konzentrieren wir uns auf die RP-Chromatographie und betrachten folgende drei Fälle: Die Probelösung kann polarer, apolarer oder einfach „anders“ als der (Anfangs-)Eluent sein. 1. Polarer – also im Sinne der RP-Chromatographie schwächer Diese Situation sollte stets angestrebt werden, denn: Wenn…
Der Fall Der Systemeignungstest („System Suitability Test“, SST) ist ein wichtiges, gleichauf sensibles Thema speziell im regulierten Umfeld. Ein Blick in der Alltagspraxis zeigt, dass bzgl. SST unterschiedliche Auffassungen herrschen betreffend Sinn, Häufigkeit und Kriterien. In diesem Tipp möchte ich dazu einige Hinweise und Anregungen geben. Die Lösung Zunächst ein paar Worte zum Sinn eines SST. Halten wir zunächst folgendes fest: In den Monographien steht „expressis verbis“, dass ein derartiger Test die Apparatur, die Proben, die Methode und die „electronics“ (sprich: Datenerfassung und – verarbeitung, d.h. einschließlich Reportdaten wie Peakfläche) umfassen soll. Das bedeutet, Ziel eines SST ist die Überprüfung…
Degasser Große Variationskoeffizienten Vorsicht beim Degasser! Degasser sind praktisch. Nichtdestotrotz sollte man an bestimmte Sachen denken: Die Effektivität des Entgasens ist abhängig vom Fluss, je geringer der Fluss, umso besser arbeitet ein Degasser Schläuche zum Ersten: Die Schläuche werden mit der Zeit porös – vor allem, wenn häufig mit Puffer gearbeitet wird. Betrachten Sie bitte die Schläuche/Membrane als Verschleißteile, je nach verwendeter mobiler Phase sollten sie alle 3-4 Jahre evtl. ausgewechselt werden Schläuche zum Zweiten: Haben Sie trotz gründlichem Spülen ein Problem mit Geisterpeaks? Es kann sein, dass dies mit den Schläuchen im Degasser zusammen hängt. Nicht nur wg. Weichmacher…
