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Veränderung der Peakfläche

Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Jahrestipps, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage? Die Lösung Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind. Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen: Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem rechtzeitig zu erkennen, ob also Gefahr für Niederschlag besteht (Tipp von Jens Braun, BioChem): Probelösung einfach kalt machen und anschließend zentrifugieren Temperatur zum Zweiten: Bessere Peakform, Zunahme der Peakfläche Wenn die Standard-/SST-lösung organischer als der Eluent/Anfangsgradient ist, entsteht Fronting, mitunter bei sehr frühen Peaks auch „Buckel“. Wenn nun aus jener Lösung im Laufe der Sequenz häufig injiziert wird, kann das organische Lösungsmittel u.U. verdampfen, Ergebnis: Aufkonzentrierung der Probe im Vial, die Peakfläche nimmt zu und dadurch, dass nun die Probelösung womöglich „Eluent-ähnlicher“ geworden ist, ergibt sich eine Verbesserung der Peakform Temperatur zum Dritten: Zunahme der Peakfläche und/oder größerer Variationskoeffizient Eine…

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Die Kleinen im Sommer – Autosampler-vials

Von Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps Demo, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

 

In diesem HPLC-Tipp geht es um diverse Probleme, die mit den Autosampler-Vials zu tun haben.

Vials, immer wieder vials…

  • Beim Schütteln eines vials (bei mir leider immer wieder eine spontane Bewegung…) kann sich auf der Unterseite des vial-caps ein Substanzfilm bilden – die Reproduzierbarkeit der Injektion lässt zu wünschen übrig. Beim Vortexieren bzw. automatischen Schütteln ist diese Gefahr eher selten gegeben, die Präzision bei Wiederholinjektionen ist in der Regel besser
  • Der Greifarm des Autosamplers hat evtl. ein vial verloren; wenn man Pech hat, versteckt sich jenes unter dem Karussell. Dadurch ist das Karussell nun etwas schief, die vials dort liegen ein wenig niedriger/höher, Ergebnis: Geänderte Peakflächen. Der Grund: Die Nadel stößt evtl. an den Wänden vom vial an oder sie kommt auf dem Boden auf. Oder aber im Falle von inhomogenen Probelösungen ergibt sich eine unterschiedliche Probekonzentration oder sogar ein Konzentrationsgradient . Und je nachdem, aus welcher Höhe die Nadel Probelösung ansaugt, ergeben sich Schwankungen der Peakfläche oder ein Trend dergleichen. Die Höhe eines vials kann sich auch dann verändern, wenn sich unter dem vial Schmutz, Dichtungsabrieb, Salzkriställchen usw. eingefunden haben
  • Hellrote vs. dunkelrote vs. Silikon vs. vorgeschlitzte vs. „Sandwitch-Septen“; Unterschiede bezüglich Abriebs bzw. Verdampfens von Probelösungsmittel bzw. Neigung zu Memoryeffekt
  • Vial richtig dicht vs. einfach „klack“ und somit eher locker aufgesetzt: Im ersten Fall ist die erste Injektion evtl. fehlerbehaftet (durch den Unterdruck beim erstmaligen Stechen der Nadel drückt sich etwas von der Probelösung in die Nadel hoch) im zweiten Fall sind alle Injektionen OK – auch die erste
  • Vial, beispielsweise Nr. 18, geht immer wieder kaputt; das ist zwar ein seltener Fall, dennoch möchte ich ihn erwähnen: Durch einen Fabrikationsfehler kann beim 6-Port-Ventil passieren, dass die zwei Scheiben nicht 100% übereinander liegen. Bei wiederholten Problemen mit Injektionen nur aus einem bestimmten vial am besten zeitnah den Hersteller wegen eines Austausches kontaktieren
  • Probleme beim Methodentransfer

Beim Methodentransfer tauchen oft deswegen Probleme auf, weil nicht alle Informationen ausgetauscht bzw. Begriffe unterschiedlich verstanden werden. Nachfolgend drei Beispiele betreffend die vials:

  • „Wir arbeiten bei diesen geringen Volumina mit Aufsätzen, die sollt ihr auch verwenden“. „OK“. Nur: In einem Labor werden die beweglichen (und billigen) Aufsätze verwendet, im anderen die festen Aufsätze. Es ergeben sich womöglich unterschiedliche Peakflächen, weil im ersten Fall die Nadel links oder rechts die Vial-Wand berühren kann…
  • „Wirkstoff X bleibt gerne hängen, ihr sollt vials mit inerter Oberfläche verwenden.“ „OK“. Nur: Versteht jede(r) unter „inert“ das Gleiche?
  • Es werden statt Glas, PP-vials verwendet; die einen haben die normalen Eppi´s die anderen die low-bind Eppi´s …
  • Die vials werden mit HCL behandelt; die Silanolgruppen auf der Glasoberfläche liegen undissoziiert vor, basische Wirkstoffe werden zwar nicht adsorbiert, Wasserstoffbrückenbindungen wären jedoch möglich
  • Es werden silanisierte vials verwendet; analog einer endcappeden C18-Phase werden nicht nur keine basische sondern überhaupt keine polare Komponenten adsorbiert
  • Es werden silikonisierte vials verwendet; durch die Silikon-Schutzschicht wird nicht lediglich Adsorption sondern auch eine Benetzung der Oberfläche verhindert, die Probelösung perlt einfach ab
  • „Wir arbeiten mit vials mit so ´ne Verjüngung, weißt Du? „Ja, wir auch!“ Nur: Erstens, können solche Aufsätze unterschiedliche Länge aufweisen. Und zweitens kann der Durchmesser am Ende der Verjüngung unterschiedlich groß sein. Dadurch kann durch die Oberflächenspannung genau dort ein Luftbläschen entstehen – und dies abhängig vom Probelösungsmittel! Ergebnis: Unterschiedliche Peakflächen

In Abbildung 1 werden Aufsätze der Firma VWR gezeigt, die die hier
erwähnten Unterschiede demonstrieren.

Abbildung 1: Aufsätze für HPLC-vials unterschiedlicher Länge und unterschiedlicher Verjüngung, Details, siehe Text

Die „Kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Schauen wir uns die in diesem Tipp beschriebenen Fälle an: Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (II)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor 1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In…

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Die „kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (I)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Betätigen wir uns gerade ein wenig „sportlich“ und betrachten nun folgende Situationen: Jeder von uns macht in seinem (HPLC-) Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen –…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

  Ein paar Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen Änderung der Peakform und der Peakfläche durch ungewollte Änderung des pH-Wertes Wiederfindung abhängig von der (Glas)Oberfläche In diesem Tipp haben wir bereits einige Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen besprochen,  auch hier wurde das Thema behandelt. Nun, weiter unten einige Weitere: Retentionszeit bei isokratischen Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Abnahme der Retentionszeit um Faktor 2 Retentionszeit bei Gradienten-Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Natürlich ebenso Abnahme der Retentionszeit, allerdings abhängig von mehreren Faktoren lediglich um ca. 10-30% Und überhaupt: Die Retentionszeit wird bei Gradientenläufen vom Start- und End % B sowie von…

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Der Einfluss des Probelösungsmittels auf das Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Doppelpeaks, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Probenlösungsmittel, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Ist die Probelösung nicht identisch mit der mobilen Phase (bzw. mit der Anfangszusammensetzung vom Eluent A bei der Gradientelution) kann dies einen Einfluss auf das Chromatogramm haben. Wie macht sich das nun genau bemerkbar? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: „Andere“ Probelösung kann vielerlei bedeuten: Andere Zusammensetzung, anderes organisches Lösungsmittel, anderer pH-Wert, andere Pufferstärke/anderes Salz etc. Konzentrieren wir uns auf die RP-Chromatographie und betrachten folgende drei Fälle: Die Probelösung kann polarer, apolarer oder einfach „anders“ als der (Anfangs-)Eluent sein. 1. Polarer – also im Sinne der RP-Chromatographie schwächer Diese Situation sollte stets angestrebt werden, denn: Wenn…

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Systemeignungstest – Sinn und Kriterien

Von Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Systemeignungstest (SST), Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Der Fall Der Systemeignungstest („System Suitability Test“, SST) ist ein wichtiges, gleichauf sensibles Thema speziell im regulierten Umfeld. Ein Blick in der Alltagspraxis zeigt, dass bzgl. SST unterschiedliche Auffassungen herrschen betreffend Sinn, Häufigkeit und Kriterien. In diesem Tipp möchte ich dazu einige Hinweise und Anregungen geben. Die Lösung Zunächst ein paar Worte zum Sinn eines SST. Halten wir zunächst folgendes fest: In den Monographien steht „expressis verbis“, dass ein derartiger Test die Apparatur, die Proben, die Methode und die „electronics“ (sprich: Datenerfassung und – verarbeitung, d.h. einschließlich Reportdaten wie Peakfläche) umfassen soll. Das bedeutet, Ziel eines SST ist die Überprüfung…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, HPLC-Tipps, Uncategorized, Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Degasser Große Variationskoeffizienten Vorsicht beim Degasser! Degasser sind praktisch. Nichtdestotrotz sollte man an bestimmte Sachen denken: Die Effektivität des Entgasens ist abhängig vom Fluss, je geringer der Fluss, umso besser arbeitet ein Degasser Schläuche zum Ersten: Die Schläuche werden mit der Zeit porös – vor allem, wenn häufig mit Puffer gearbeitet wird. Betrachten Sie bitte die Schläuche/Membrane als Verschleißteile, je nach verwendeter mobiler Phase sollten sie alle 3-4 Jahre evtl. ausgewechselt werden Schläuche zum Zweiten: Haben Sie trotz gründlichem Spülen ein Problem mit Geisterpeaks? Es kann sein, dass dies mit den Schläuchen im Degasser zusammen hängt. Nicht nur wg. Weichmacher…

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Der Probengeber als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Robustheit, Veränderung der Peakfläche

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns über Probleme betreffend den Detektor unterhalten. Hier wollen wir uns anschauen, welche typische Autosampler-Probleme zu einer schlechten Reproduzierbarkeit und/oder falschen Peakfläche führen können. Die Lösung Einige Probleme beeinträchtigen typischerweise die Reproduzierbarkeit der Injektion, d.h. der Vk ist beispielsweise bei einer 6-fachen Injektion aus einem vial nicht zufriedenstellend. Hier wäre als Ursache eine zu schnelle Ansauggeschwindigkeit („Aspiration Rate“ oder „Aspiration Time“) im Falle von viskosen Probelösungen zu nennen, merke: Auch Wasser/Puffer als Probelösung ist recht viskos! Andere Ursachen wiederum führen zu einer falschen Peakfläche. Die irreversible Adsorption an der Nadel wäre ein Beispiel…

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