Der Fall

Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage?

Die Lösung

Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind.

Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen:

Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen

  • Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem rechtzeitig zu erkennen, ob also Gefahr für Niederschlag besteht (Tipp von Jens Braun, BioChem): Probelösung einfach kalt machen und anschließend zentrifugieren

Temperatur zum Zweiten: Bessere Peakform, Zunahme der Peakfläche

  • Wenn die Standard-/SST-lösung organischer als der Eluent/Anfangsgradient ist, entsteht Fronting, mitunter bei sehr frühen Peaks auch „Buckel“. Wenn nun aus jener Lösung im Laufe der Sequenz häufig injiziert wird, kann das organische Lösungsmittel u.U. verdampfen, Ergebnis: Aufkonzentrierung der Probe im Vial, die Peakfläche nimmt zu und dadurch, dass nun die Probelösung womöglich „Eluent-ähnlicher“ geworden ist, ergibt sich eine Verbesserung der Peakform

Temperatur zum Dritten: Zunahme der Peakfläche und/oder größerer Variationskoeffizient

  • Eine häufige Praxis: Damit bei einer Verwendung von vorgeschlitzten Septen kein Lösungsmittel aus dem Vial entweichen kann, wird die Temperatur des Probengebers gesenkt. Die Peakflächen nehmen mit der Zeit evtl. zu, eine mögliche Ursache wäre: Die Ansaug- (aspiration time) – aber auch die Injektionsgeschwindigkeit! – wurde der sich geänderten Viskosität nicht angepasst. Injektionen von viskosen Probelösungen bei relativer großer Ansauggeschwindigkeit führen ferner zu großen Variationskoeffizienten (unreproduzierbare Peakflächen)

Geisterpeaks, die erst später erscheinen

  • In Tetrahydrofuran von HPLC-Qualität sind erwartungsgemäß keine Stabilisatoren enthalten. Wenn nun die THF-Flasche etwas älter und auch keine Stickstoff-Atmosphäre vorhanden ist und die Flasche weder mit Alufolie umwickelt ist noch im dunklen Schrank/Kühlschrank aufbewahrt wird, können Peroxide entstehen. Diese sammeln sich am Säulenkopf und eluieren erst später gegen Ende eines Gradientenlaufs

Verschiebung der Retentionszeit verbunden mit Veränderung, meist Verschlechterung, der Peakform  

  • Durch eine etwas „schiefe“ Bewegung des Kolbens in der Pumpe kann Eluent in die Flüssigkeit der Hinterkolbenspülung gelangen. Überprüfung: Die Flüssigkeit vermehrt sich auf wundersamen Weisen, auch ein einfacher sensorischer Test offenbart das Problem. Durch eine derartige, zwar geringe jedoch stete Veränderung der Eluentenzusammensetzung ergibt sich eine schleichende Retentionszeitverschiebung
  • Bei bestimmten nicht-silanisierten Vials kann der pH-Wert einer wässrigen Probelösung innerhalb einer Stunde u.U. sich um mehr als eine pH-Einheit ändern
  • Bestandteile der Probe verändern im Laufe der Zeit das Füllmaterial der Säule, die Wechselwirkungen ändern sich ebenso, z. B. Schwermetallionen belegen die Kieselgelmatrix, Matrixbestandteile wie Stärke, Fette, Dextrane, Fette, Propylenglykol usw. die Oberfläche der stationären Phase – die Probleme erscheinen erst mit der Zeit …

Das Fazit

Vor der Adaption einer Methode in der Routine ist es im Falle von vorgesehenen langen Sequenzen ratsam, die Stabilität chromatographischer Größen wie Retentionszeit und Peakfläche über die Zeit gezielt zu testen. Oft werden bei der Methodenentwicklung keine langen Sequenzen verwendet, mögliche Probleme bleiben somit am Anfang im Verborgenen.