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Geisterpeaks Archive - Dr. Stavros Kromidas

Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Monatstipp, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall

Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage?

Die Lösung

Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind.

Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen:

Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen

  • Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem rechtzeitig zu erkennen, ob also Gefahr für Niederschlag besteht (Tipp von Jens Braun, BioChem): Probelösung einfach kalt machen und anschließend zentrifugieren

Temperatur zum Zweiten: Bessere Peakform, Zunahme der Peakfläche

  • Wenn die Standard-/SST-lösung organischer als der Eluent/Anfangsgradient ist, entsteht Fronting, mitunter bei sehr frühen Peaks auch „Buckel“. Wenn nun aus jener Lösung im Laufe der Sequenz häufig injiziert wird, kann das organische Lösungsmittel u.U. verdampfen, Ergebnis: Aufkonzentrierung der Probe im Vial, die Peakfläche nimmt zu und dadurch, dass nun die Probelösung womöglich „Eluent-ähnlicher“ geworden ist, ergibt sich eine Verbesserung der Peakform

Temperatur zum Dritten: Zunahme der Peakfläche und/oder größerer Variationskoeffizient

  • Eine häufige Praxis: Damit bei einer Verwendung von vorgeschlitzten Septen kein Lösungsmittel aus dem Vial entweichen kann, wird die Temperatur des Probengebers gesenkt. Die Peakflächen nehmen mit der Zeit evtl. zu, eine mögliche Ursache wäre: Die Ansaug- (aspiration time) – aber auch die Injektionsgeschwindigkeit! – wurde der sich geänderten Viskosität nicht angepasst. Injektionen von viskosen Probelösungen bei relativer großer Ansauggeschwindigkeit führen ferner zu großen Variationskoeffizienten (unreproduzierbare Peakflächen)

Geisterpeaks, die erst später erscheinen

  • In Tetrahydrofuran von HPLC-Qualität sind erwartungsgemäß keine Stabilisatoren enthalten. Wenn nun die THF-Flasche etwas älter und auch keine Stickstoff-Atmosphäre vorhanden ist und die Flasche weder mit Alufolie umwickelt ist noch im dunklen Schrank/Kühlschrank aufbewahrt wird, können Peroxide entstehen. Diese sammeln sich am Säulenkopf und eluieren erst später gegen Ende eines Gradientenlaufs

Verschiebung der Retentionszeit verbunden mit Veränderung, meist Verschlechterung, der Peakform  

  • Durch eine etwas „schiefe“ Bewegung des Kolbens in der Pumpe kann Eluent in die Flüssigkeit der Hinterkolbenspülung gelangen. Überprüfung: Die Flüssigkeit vermehrt sich auf wundersamen Weisen, auch ein einfacher sensorischer Test offenbart das Problem. Durch eine derartige, zwar geringe jedoch stete Veränderung der Eluentenzusammensetzung ergibt sich eine schleichende Retentionszeitverschiebung
  • Bei bestimmten nicht-silanisierten Vials kann der pH-Wert einer wässrigen Probelösung innerhalb einer Stunde u.U. sich um mehr als eine pH-Einheit ändern
  • Bestandteile der Probe verändern im Laufe der Zeit das Füllmaterial der Säule, die Wechselwirkungen ändern sich ebenso, z. B. Schwermetallionen belegen die Kieselgelmatrix, Matrixbestandteile wie Stärke, Fette, Dextrane, Fette, Propylenglykol usw. die Oberfläche der stationären Phase – die Probleme erscheinen erst mit der Zeit …

Das Fazit

Vor der Adaption einer Methode in der Routine ist es im Falle von vorgesehenen langen Sequenzen ratsam, die Stabilität chromatographischer Größen wie Retentionszeit und Peakfläche über die Zeit gezielt zu testen. Oft werden bei der Methodenentwicklung keine langen Sequenzen verwendet, mögliche Probleme bleiben somit am Anfang im Verborgenen.

Vials als Quelle für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Probengeber

Vials – Glas-/Polymerkörper, Septen, Kappen – können eine Quelle für Geisterpeaks sein; nachfolgend skizziere ich einige Ursachen sowie mögliche Tests zum Erfassen und ggf. Lokalisierung des Problems. Mehrfache Injektion aus einem vial; erste Injektion OK, zweite und dritte, Geisterpeaks, vierte OK. Man kann schier verzweifeln…Eine mögliche Erklärung: Bei der ersten Injektion durchsticht die Nadel das erste Mal das frische Septum, es wird injiziert, alles bestens. Nach der Injektion erfolgt üblicherweise ein Purgen der Nadel. Bei der anschließenden zweiten Injektion befindet sich durch das Purgen womöglich Restlösungsmittel an der Außen-Oberfläche der Nadel. Jenes Lösungsmittel kann nun an der jetzt frei gewordenen Septum-Oberfläche an der Stichstelle Hilfsstoffe aus dem Septum herauslösen, die als kleine Zusatzpeaks erscheinen. Dies passiert vielleicht nur 1-2 Mal, denn: Die Konzentration dieser Hilfsstoffe ist gering, nach der vierten oder fünften Injektion sind sie „weg“, ab jetzt sind keine Geisterpeaks mehr zu sehen Die Probe befindet sich im Kühlschrank. Um einen Temperatur- und somit einen Konzentrationsgradienten im vial zu verhindern wird jenes gründlich durchgeschüttelt. Je nach Lösungsmittel in der Probelösung können Hilfsstoffe aus der Unterfläche des Septums herausgelöst werden – es erscheinen Geisterpeaks Teflon auf Gummi bei neuen Septen: Geisterpeaks Folgendes Problem dürfte nur bei älteren Materialien auftauchen, dennoch…

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Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Von Allgemein, Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Methodentransfer, Monatstipp, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung des Chromatogramms

Geisterpeaks – aber erst „später“
Verbesserung der Empfindlichkeit

Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen

Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):

          Katalytische Wirkung des Kieselgels

  • Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit spät eluieren. Sind solche Substanzen in der Probe enthalten, so erscheinen evtl. Geisterpeaks. Fehlen diese Komponenten, eluieren nur Komponenten, die schwache Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen, die Geisterpeaks fehlen

    Verstärkt Hydrolyse durch ungewollte Veränderung chromatographischer Parameter
  • Stellen wir uns eine lange Sequenz vor: bei den gegen Ende der Sequenz zu injizierenden Proben herrscht im vial evtl. eine andere Temperatur als bei den Proben davor (z. B. Temperaturdifferenz Kühlschrank-Probengeber oder Temperaturgradient im Probenraum des Probengebers)
  • Auch folgendes wäre im Falle einer langen Sequenz denkbar: der pH-Wert im vial ändert sich mit der Zeit – aus welchen Gründen auch immer – und ab einem bestimmten pH-Wert sind allerlei Veränderungen der Probe denkbar und somit erscheinen zusätzliche Substanzen erst nach einer gewissen Zeit

    Oxidationsprodukte
  • Man/frau arbeitet mit Tetrahydrofuran (THF) in der mobilen Phase; ein Blindgradient zu Beginn zeigt keine Probleme. Mögliche Peroxide aus dem THF sammeln sich allerdings erst mit der Zeit an der Säule und erscheinen nach einer Zeit X als Geisterpeaks gegen Ende des Gradienten. Man/frau wundert sich wieso erst nach so und so vielen Stunden bei den Nachtläufen Geisterpeaks auftauchen…
  • Trotz sicherlich Endreinigung der Dichtungen vor Auslieferung, kann eine Rest-Fettschicht auf deren Oberfläche vorhanden sein. Deren Oxidationsprodukten (z. B. N-Oxide) können als Geisterpeaks erscheinen, die Anzahl und der Zeitpunkt kann von der Arbeitsweise abhängig sein: Anzahl der Läufe, Temperatur, Eluent, Zusammensetzung der mobilen Phase bei der Lagerung usw.Auffüllen des Vorratsgefäßes
  • In Acetonitril können Polymere entstehen. Wird das Vorratsgefäß stets aufgefüllt sobald ca. die Hälfte des Lösungsmittels aufgebraucht ist, gibt es keine Probleme, deren Konzentration ist gering. Erfolgt das Auffüllen nicht immer zum gleichen Zeitpunkt, kann passieren, dass bei geringer Flüssigkeitsmenge im Vorratsgefäß die Polymer-Konzentration derart hoch ist, dass neben „Wellen“ in der Basislinie auch Geisterpeaks erscheinen. Also frei nach Giovanni Trapattoni: „Flasche voll: Keine Probleme, Flasche (fast) leer: Probleme

Verbesserung der Empfindlichkeit

Über das Thema haben wir uns an dieser Stelle bereits mehrfach unterhalten. Da es wichtig ist, möchte ich weiter unten die aus meiner Sicht effektivsten Maßnahmen verdichtet zusammenfassen. Das Ziel lautet: Möglichst große, schmale, symmetrische Peaks.

  1. Optimale Bedingungen bezüglich Hard- und Software:
  • *Geringes Dispersionsvolumen (vereinfacht: Totvolumen)
  •   Notwendig bei bestimmten Analyten: Inerte/Bio-inerte/Metall-freie Anlage und inerte bzw. Peek-ummantelte Säule,    silanisierte vials
  • *Falls möglich, mit Luftsegmenten zwischen Probengeber und Säule arbeiten, um eine Verdünnung der Substanzzone
    zu verhindern
  • *Optimale Settings, z. B. mindestens 40 Datenpunkte, 16 nm Spalt, 50 ms Zeitkonstante, Rauschen-Unterdrückung
  •   Je nach verwendeter Detektionsart und Analyt-Stabilität das technisch maximal Machbare nutzen, z. B: Max-
    Light/LightPipe (UV), Triple Quad MS (LC-MS), ICP-MS
  1. Chromatographische Parameter:
  • Nach Möglichkeit kurze, in jedem Fall dünne Säulen; wenn die Voraussetzungen gegeben sind, evtl. auch an Kapillaren denken
  • Core Shell- (1,3-1,7 µm) oder falls es porös sein muss, Sub2µm-Material
  • *Stets schwächeres Probelösungsmittel im Vergleich zum Anfangsgradienten verwenden: Anreicherung der
    Substanzzone am Säulenkopf; ggf. mit Hilfe eines Schaltventils Anreicherung in einer Trap-Säule in Erwägung ziehen
  • *Steiler Gradient mit 30-40 % B beginnend
  • *Bei thermostabilen Komponenten tendenziell bei höheren Temperaturen chromatographieren

Die mit „*“ versehenen Maßnahmen sind relativ schnell umzusetzen, der Rest ist mit einem gewissen Aufwand verbunden, der Nutzen kann nur individuell bewertet werden.

Die Kleinen im Sommer: Permanent auftretender Geisterpeak, Faustregeln zu Log P und Log D, Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache

Von A Fehlersuche, Auflösung, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Systemeignungstest (SST), Uncategorized

  Permanent auftretender Geisterpeak Faustregeln zu Log P und Log D Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache Seit kurzem erscheint ein Geisterpeak bzw. stets ein Blindwert im Blank… Seit einiger Zeit taugt bei einer Methode – oder bei mehreren – die noch vor kurzem keine Probleme machte(n), ein Geisterpeak auf. Oder aber, Sie haben in Ihrem Blank auf einmal stets einen Blindwert. Und dieses Problem haben Sie unabhängig von der Anlage, dem/der Anwender(in) und sogar der Methode. D.h. das übliche Fehler-Ausschluss-Programm haben Sie gründlich aber leider erfolglos absolviert. Versuchen Sie in einem solchen Fall im Team sich zu erinnern,…

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HPLC im Frühjahr… 

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Auto-Sampler, Detektor, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche…

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Die Kleinen im Sommer – Ursachen für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Der Fall Geisterpeaks sind immer wieder ein Problem – leider. Obschon häufig behandelt, möchte ich erneut das Thema aufgreifen und weiter unten ein paar eher seltenere Ursachen für plötzlich auftauchende Peaks schildern. Welche wären das? Die Lösung Vorbemerkung: Bei auftretenden Problemen frage ich die KollegInnen generell als erstes: „Habt ihr irgendetwas geändert, gab es etwaige räumliche Änderungen/Ereignisse, die mit dem Auftauchen des Problems zeitlich zusammen fallen“? Und dann kommt als Antwort, oft viel zu schnell: „Nein“. Bevor dieses „nein“ kommt, überlegen Sie sich bitte, ob vielleicht doch HPLC-relevante Sachen geändert wurden bzw. etwas „aus-der-Reihe“ passiert ist oder einfach anders läuft….

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Geisterpeaks durch Rückstände in der Mischkammer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Von Werner Röpke, Braunschweig Der Fall In einer von mehreren Benutzern abwechselnd gefahrenen HPLC-Gradientenanlage treten immer wieder unerklärliche Störungen im Chromatogramm auf, die auch durch intensives Spülen nicht zu beseitigen sind. Die Störungen halten sich hartnäckig, auch bei mehrfachem Durchlauf von Leergradienten ohne Säule. Probleme mit dem Injektionsventil können insoweit ausgeschlossen werden, als dass das Ventil nicht betätigt wird und die Störungen trotzdem auftreten. Die Lösung Die wenigsten Laboratorien sind in der Lage, für eine bestimmte HPLC-Analytik eine einzige Anlage vorzuhalten. Ein Laufmittelwechsel, auch mit sorgfältigstem Spülen unter Verwendung intermediärer Phasen, hinterlässt immer Spuren. Isokratische HPLC-Systeme sind etwas unempfindlicher, denn…

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Die „Kleinen“ im Sommer …

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Methodentransfer, polare Komponenten, Uncategorized

„Was sollte ich denn machen, die hatten nur Vodka…“ Folgende Anekdote eines Kollegen aus den Anfängen der HPLC: Er war um 1980 herum in der Sowjetunion auf Kundenreise. Im tiefsten Sibirien angekommen, wollte er nach einem Kundengespräch als Beleg für das Besprochene auch ein paar praktische Versuche durchführen – manch einer war logischerweise etwas misstrauisch gegenüber Versprechungen aus dem Westen… Damals war es mit dem Zoll noch schwieriger als heute, er konnte gerade zwei Säulen dabei haben, es waren je eine 25 cm lange Spherisorb C8 bzw. Spherisorb CN. Mit MeOH und ACN war natürlich „nichts“, aber Vodka, davon war…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Totvolumen, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, HPLC-Tipps, Uncategorized, Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Degasser Große Variationskoeffizienten Vorsicht beim Degasser! Degasser sind praktisch. Nichtdestotrotz sollte man an bestimmte Sachen denken: Die Effektivität des Entgasens ist abhängig vom Fluss, je geringer der Fluss, umso besser arbeitet ein Degasser Schläuche zum Ersten: Die Schläuche werden mit der Zeit porös – vor allem, wenn häufig mit Puffer gearbeitet wird. Betrachten Sie bitte die Schläuche/Membrane als Verschleißteile, je nach verwendeter mobiler Phase sollten sie alle 3-4 Jahre evtl. ausgewechselt werden Schläuche zum Zweiten: Haben Sie trotz gründlichem Spülen ein Problem mit Geisterpeaks? Es kann sein, dass dies mit den Schläuchen im Degasser zusammen hängt. Nicht nur wg. Weichmacher…

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