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Probengeber

Zwei kleine Sommer-Tipps

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, Bodenzahl, Injektionsvolumen, Jahrestipps, kleine Peaks, Probengeber

Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen „Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse Temperatur   Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen? Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei 10 °C Abb. 1 Unterschiedliche  Beeinflussung von Selektivität und Retentionszeit bei einer Änderung der Temperatur, Details, siehe Text Die Trennleistung (= Effizienz), also letzten Endes die Peakform, kann sich bei einer Temperaturerhöhung um ca. 4 °C, T1 auf T2, nur minimal (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Val-Phase“, Abbildung 2) oder auch merklich verbessern (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Pro-Phase“, Abbildung 2). Das Ausmaß ist demnach abhängig – auch von der Säule   Abb. 2 Abhängig von der Säule, merkliche oder geringe Verbesserung der Peakform bei einer Temperaturerhöhung, Details, siehe Text Selbes Gerät, unterschiedliche Ergebnisse An einem qualifizierten und technisch einwandfreien…

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Vials als Quelle für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Probengeber

Vials – Glas-/Polymerkörper, Septen, Kappen – können eine Quelle für Geisterpeaks sein; nachfolgend skizziere ich einige Ursachen sowie mögliche Tests zum Erfassen und ggf. Lokalisierung des Problems. Mehrfache Injektion aus einem vial; erste Injektion OK, zweite und dritte, Geisterpeaks, vierte OK. Man kann schier verzweifeln…Eine mögliche Erklärung: Bei der ersten Injektion durchsticht die Nadel das erste Mal das frische Septum, es wird injiziert, alles bestens. Nach der Injektion erfolgt üblicherweise ein Purgen der Nadel. Bei der anschließenden zweiten Injektion befindet sich durch das Purgen womöglich Restlösungsmittel an der Außen-Oberfläche der Nadel. Jenes Lösungsmittel kann nun an der jetzt frei gewordenen Septum-Oberfläche an der Stichstelle Hilfsstoffe aus dem Septum herauslösen, die als kleine Zusatzpeaks erscheinen. Dies passiert vielleicht nur 1-2 Mal, denn: Die Konzentration dieser Hilfsstoffe ist gering, nach der vierten oder fünften Injektion sind sie „weg“, ab jetzt sind keine Geisterpeaks mehr zu sehen Die Probe befindet sich im Kühlschrank. Um einen Temperatur- und somit einen Konzentrationsgradienten im vial zu verhindern wird jenes gründlich durchgeschüttelt. Je nach Lösungsmittel in der Probelösung können Hilfsstoffe aus der Unterfläche des Septums herausgelöst werden – es erscheinen Geisterpeaks Teflon auf Gummi bei neuen Septen: Geisterpeaks Folgendes Problem dürfte nur bei älteren Materialien auftauchen, dennoch…

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Die Kleinen im Sommer – Autosampler-vials

Von Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps Demo, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

 

In diesem HPLC-Tipp geht es um diverse Probleme, die mit den Autosampler-Vials zu tun haben.

Vials, immer wieder vials…

  • Beim Schütteln eines vials (bei mir leider immer wieder eine spontane Bewegung…) kann sich auf der Unterseite des vial-caps ein Substanzfilm bilden – die Reproduzierbarkeit der Injektion lässt zu wünschen übrig. Beim Vortexieren bzw. automatischen Schütteln ist diese Gefahr eher selten gegeben, die Präzision bei Wiederholinjektionen ist in der Regel besser
  • Der Greifarm des Autosamplers hat evtl. ein vial verloren; wenn man Pech hat, versteckt sich jenes unter dem Karussell. Dadurch ist das Karussell nun etwas schief, die vials dort liegen ein wenig niedriger/höher, Ergebnis: Geänderte Peakflächen. Der Grund: Die Nadel stößt evtl. an den Wänden vom vial an oder sie kommt auf dem Boden auf. Oder aber im Falle von inhomogenen Probelösungen ergibt sich eine unterschiedliche Probekonzentration oder sogar ein Konzentrationsgradient . Und je nachdem, aus welcher Höhe die Nadel Probelösung ansaugt, ergeben sich Schwankungen der Peakfläche oder ein Trend dergleichen. Die Höhe eines vials kann sich auch dann verändern, wenn sich unter dem vial Schmutz, Dichtungsabrieb, Salzkriställchen usw. eingefunden haben
  • Hellrote vs. dunkelrote vs. Silikon vs. vorgeschlitzte vs. „Sandwitch-Septen“; Unterschiede bezüglich Abriebs bzw. Verdampfens von Probelösungsmittel bzw. Neigung zu Memoryeffekt
  • Vial richtig dicht vs. einfach „klack“ und somit eher locker aufgesetzt: Im ersten Fall ist die erste Injektion evtl. fehlerbehaftet (durch den Unterdruck beim erstmaligen Stechen der Nadel drückt sich etwas von der Probelösung in die Nadel hoch) im zweiten Fall sind alle Injektionen OK – auch die erste
  • Vial, beispielsweise Nr. 18, geht immer wieder kaputt; das ist zwar ein seltener Fall, dennoch möchte ich ihn erwähnen: Durch einen Fabrikationsfehler kann beim 6-Port-Ventil passieren, dass die zwei Scheiben nicht 100% übereinander liegen. Bei wiederholten Problemen mit Injektionen nur aus einem bestimmten vial am besten zeitnah den Hersteller wegen eines Austausches kontaktieren
  • Probleme beim Methodentransfer

Beim Methodentransfer tauchen oft deswegen Probleme auf, weil nicht alle Informationen ausgetauscht bzw. Begriffe unterschiedlich verstanden werden. Nachfolgend drei Beispiele betreffend die vials:

  • „Wir arbeiten bei diesen geringen Volumina mit Aufsätzen, die sollt ihr auch verwenden“. „OK“. Nur: In einem Labor werden die beweglichen (und billigen) Aufsätze verwendet, im anderen die festen Aufsätze. Es ergeben sich womöglich unterschiedliche Peakflächen, weil im ersten Fall die Nadel links oder rechts die Vial-Wand berühren kann…
  • „Wirkstoff X bleibt gerne hängen, ihr sollt vials mit inerter Oberfläche verwenden.“ „OK“. Nur: Versteht jede(r) unter „inert“ das Gleiche?
  • Es werden statt Glas, PP-vials verwendet; die einen haben die normalen Eppi´s die anderen die low-bind Eppi´s …
  • Die vials werden mit HCL behandelt; die Silanolgruppen auf der Glasoberfläche liegen undissoziiert vor, basische Wirkstoffe werden zwar nicht adsorbiert, Wasserstoffbrückenbindungen wären jedoch möglich
  • Es werden silanisierte vials verwendet; analog einer endcappeden C18-Phase werden nicht nur keine basische sondern überhaupt keine polare Komponenten adsorbiert
  • Es werden silikonisierte vials verwendet; durch die Silikon-Schutzschicht wird nicht lediglich Adsorption sondern auch eine Benetzung der Oberfläche verhindert, die Probelösung perlt einfach ab
  • „Wir arbeiten mit vials mit so ´ne Verjüngung, weißt Du? „Ja, wir auch!“ Nur: Erstens, können solche Aufsätze unterschiedliche Länge aufweisen. Und zweitens kann der Durchmesser am Ende der Verjüngung unterschiedlich groß sein. Dadurch kann durch die Oberflächenspannung genau dort ein Luftbläschen entstehen – und dies abhängig vom Probelösungsmittel! Ergebnis: Unterschiedliche Peakflächen

In Abbildung 1 werden Aufsätze der Firma VWR gezeigt, die die hier
erwähnten Unterschiede demonstrieren.

Abbildung 1: Aufsätze für HPLC-vials unterschiedlicher Länge und unterschiedlicher Verjüngung, Details, siehe Text

HPLC im Frühjahr… 

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Auto-Sampler, Detektor, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Probengeber, Uncategorized, Verweilvolumen

Übernahme einer Methode in die Routine, Formulierungen in Prüfvorschriften… Eine Gradienten-Methode wurde mit einer Pumpe entwickelt, die keinen Pulsationsdämpfer enthielt. Das merkliche aber doch eher geringe Rauschen der Basislinie hat den Methodenentwickler nicht weiter gestört. Der Routineanwender hat für sein baugleiches Gerät (Niederdruckgradient) einen Pulsationsdämpfer bestellt und einbauen lassen, weil er bei den zu erwartenden kleinen Peaks größere Probleme in der täglichen Integration verhindern wollte. Das Rauschen war tatsächlich signifikant kleiner geworden. Aber: Die Retentionszeit hat sich verschoben, das Chromatogramm sah anders aus. Erklärung: Durch den Pulsationsdämpfer hat sich das Verweilvolumen (Dwell volume) der Apparatur geändert und dies kann leider…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Uncategorized

Peakfläche und Injektion, Spülen von RP-Säulen Mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche (hier: Injektor) Weitgehend bekannte Ursachen wie Leckage, Luft in der Spritze, verstopftes Nadelloch durch Dichtungsmaterial/Septumpartikelchen/Salz etc. lassen wir heute außer Acht, ich würde gerne eher auf Sachen eingehen, an die man vielleicht nicht sofort denkt. Nachfolgend stichwortartig einige Ideen und Denkanstöße. Erstes großes Thema: Memory-Effekt durch Physisorption bestimmter Analyte an unterschiedlichen Oberflächen. Merke: Die Affinität gegenüber Oberflächen hängt nicht nur vom Material der Oberfläche selbst, sondern auch von den chromatographischen Bedingungen ab. Unterschiedliches Material der Kapillare (Peek vs. Stahl) Unterschiedliches Material der Nadel (Stahl vs. Messing vs. Titan vs. Peek vs. Keramik) auch…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Schauen wir uns die in diesem Tipp beschriebenen Fälle an: Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (II)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor 1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In…

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Die „kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (I)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Betätigen wir uns gerade ein wenig „sportlich“ und betrachten nun folgende Situationen: Jeder von uns macht in seinem (HPLC-) Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen –…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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Der Probengeber als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Robustheit, Veränderung der Peakfläche

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns über Probleme betreffend den Detektor unterhalten. Hier wollen wir uns anschauen, welche typische Autosampler-Probleme zu einer schlechten Reproduzierbarkeit und/oder falschen Peakfläche führen können. Die Lösung Einige Probleme beeinträchtigen typischerweise die Reproduzierbarkeit der Injektion, d.h. der Vk ist beispielsweise bei einer 6-fachen Injektion aus einem vial nicht zufriedenstellend. Hier wäre als Ursache eine zu schnelle Ansauggeschwindigkeit („Aspiration Rate“ oder „Aspiration Time“) im Falle von viskosen Probelösungen zu nennen, merke: Auch Wasser/Puffer als Probelösung ist recht viskos! Andere Ursachen wiederum führen zu einer falschen Peakfläche. Die irreversible Adsorption an der Nadel wäre ein Beispiel…

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