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Fluss

Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Monatstipp, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen,

zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.

Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.

In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.

 

Änderung (Symptom)Ursache(n)Welches Symptom noch?Kommentar
∆ A + ∆ H1. ∆ Injektionsvolumen

2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt)
3. ∆ Detektor

4. Instabile Probe

5. ∆ pH-Wert

6. ∆ Probekonzentration

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ∆ Peakform

1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit
2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen)
3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle
5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen
6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR,
A = konstant
1. Eluent
2. ∆ stationäre Phase
3. ∆ Temperatur
1. ∆ P

 

 

3. ∆ P

Stets:
t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel
auch
∆ Peakform

1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H,
A = konstant
∆ PackungsqualitättR = konstant,

Verschlechterung der Peakform

∆ tR, ∆ t0, ∆ A,
H = fast konstant
∆ Fluss∆ P Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform –
alle Peaks
 

1. Totvolumen
2. Verschlechterung der Packungsqualität

 

tR = konstant

Schlechte Peakform –
einige Peaks
∆ pH-WertBetroffene Peaks: ∆ tREtwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks1. Hohlraum im Packungsbeet
2. Verbogene Injektionsnadel
3. Substanz liegt in zwei Formen vor
 

 

3. pH-Wert minimal verändern

 

 

Woher kommt das?

Von A Fehlersuche, Bodenzahl, Detektor, Fluss, Injektionsvolumen, Jahrestipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Pumpe, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Typischen Symptomen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden; oder aber die Zahl der infrage kommenden Ursachen kann durch Beurteilung der Symptome („Welche Veränderung kann dieses Symptom bedingen und welche definitiv nicht?“) wenigstens eingegrenzt werden. Nachfolgend werden beispielhaft sieben häufige „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. Bei Bedarf erfolgt auch ein Kommentar. Für die vorgestellten Fälle gelten folgende Annahmen: Keine bewusste Änderung seitens der Anwender:innen, z. B. es wurde keine längere Säule eingebaut Es handelt sich vorwiegend um RP-Trennungen mit einem konzentrationsempfindlichen Detektor wie beispielsweise UVVis, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor Weiter unten sind die häufigsten Ursachen genannt Symbole: ∆: Änderung H: Peakhöhe A: Peakfläche T: Temperatur P: Druck c: Konzentration tR: Retentionszeit t0: Totzeit (Front, Injektionspeak) In der Tabelle weiter unten befindet sich auch die Spalte „Welches Symptom noch?“. Sie ist leer. Liebe Leser:innen, es könnte sein, dass Sie um den Jahreswechsel herum ein wenig Zeit haben … Sollte dies der Fall sein und Sie Lust verspüren, könnten Sie sich überlegen, welches Symptom zum jeweiligen Fall zusätzlich „passt“, also: Welcher Parameter bleibt zusätzlich konstant, welcher ändert sich noch? Im ersten Tipp des Jahres 2023 werden Sie dort manches finden. Ich wünsche Ihnen ein friedliches Fest und viel Spaß!   Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Schauen wir uns die in diesem Tipp beschriebenen Fälle an: Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (II)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor 1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In…

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Die „kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (I)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Betätigen wir uns gerade ein wenig „sportlich“ und betrachten nun folgende Situationen: Jeder von uns macht in seinem (HPLC-) Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen –…

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Die Vorsäule – nicht nur als „Vorsäule“ zu nutzen…

Von B Optimierung, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Säule, Veränderung der Peakfläche, Vorsäule

Der Fall Mit einigen Anwendern habe ich vor Ort ein Paar einfache Optimierungsexperimente durchgeführt. Wir haben einiges ausprobiert, nachfolgend werden 1-2 Ergebnisse vorgestellt. Uns ging es vor allem um die Frage: Was ist mit einfachen Mitteln möglich und was „bringt“ wann, was? Die Lösung Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt. Man betrachte Abb. 1. Es handelt sich um die Injektion von 50 µl einer recht komplexen Probe (Linearer Puffer/ACN-Gradient, Fluss: 1,6 ml/min, Kromasil C18, 5µm). Abb. 1 Injektion einer 50 µl Probe bei F=1,6 ml/min, Details, siehe Text Im vorliegenden Fall interessiert am meisten…

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Unterschiede in den HPLC-Anlagen – die Peakfläche

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Fluss, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Dass Geräte von unterschiedlichen Herstellern große Unterschiede aufweisen können, ist eine HPLC-Binsenweisheit. Der Unterschied kann im Verweilvolumen bei Gradientenanlagen liegen (Hochdruck vs. Niederdruck), in der Richtigkeit bei der Wellenlängeneinstellung (z. B. +/- 2 nm vs. +/- 4 nm), im Material der Nadel im Probengeber (z. B. Stahl vs. Keramik) und damit verbunden evtl. Memoryeffekte, in der unterschiedlichen Geometrie der Mischkammer oder der Detektorzelle bei u. U. identischem Volumen und, und…Diese Unterschiede sowie die Folgen sind erfahrenen AnwenderInnen bekannt: Unterschiede in der Retentionszeit, in der Peakfläche und in der Peakform. Im hiesigen Peak möchte ich gerne auf zwei Sachen…

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Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch OK?

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Sie stellen fest, dass bei Wiederholinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss in Ordnung sind? Die Lösung Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat OK. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich,…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Nachweisgrenze, Optimierung, Uncategorized

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H3PO4 oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an…

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Fehlersuche: Probleme, Ursache(n), Lösung(en)

Von A Fehlersuche, Doppelpeaks, Fluss, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Im Alltag helfen bei auftretenden Problemen schnelle Lösungen. Das Wälzen von Handbüchern ist in solchen Fällen weniger hilfreich, googeln vielleicht eher. Frau Anja Olschewski, Landesumweltamt Essen, hat sich die Mühe gemacht und manch eine Hilfestellung (auch) aus dem Internet zusammengestellt. Es ist eine praxisbezogene Tabelle für den Alltag entstanden, die mir gut gefallen hat. Sie wird nachfolgend von ihr aus kollegialer „Liebe“ für HPLC-Menschen zur Verfügung gestellt. Die Lösung Das Fazit Für eine Reihe von Symptomen gibt es häufig eindeutige Ursachen. Eine wie hier vorgestellte Tabelle, vielleicht um Ihre Erfahrungen erweitert, am besten direkt am Gerät angebracht, hilft,…

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Wie lange sollte die übliche Equilibrierzeit bei einer RP-Säule sein?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Eine RP-Säule ist häufig zu equilibrieren: Beim „Einfahren“, wenn sie neu ist, beim Umspülen, wenn ein neuer Eluent eingesetzt wird, nach einem Gradientenlauf vor der nächsten Injektion, wenn sie nach getaner Arbeit gelagert wird usw. Wie lange sollte dieser Vorgang nun dauern? Die Lösung Halten wir zunächst folgendes fest: Die Frage sollte weniger lauten „wie lange?“ sondern viel mehr „wie viel Volumen sollte ich über die Säule schicken?“ Beim Einfahren, Um- bzw. Spülen gilt als Faustregel: Ca. 10-15 Säulenvolumina pro Spülschritt bei einfachen Eluenten bzw. üblichen Verunreinigungen und 30-50 Säulenvolumina pro Spülschritt im Falle von komplexeren Eluenten bzw….

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