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Optimierung

Eine passende Frage zu diesem Befund …

Von A Fehlersuche, Allgemein, B Optimierung, Eluent, Jahrestipps, Monatstipp, Optimierung, pH-Wert des Eluenten

Liebe Leserinnen, liebe Leser,

weiter unten finden Sie den jeweils ersten Teil der halben Sätze aus dem Dezember-Tipp, so dass nun die Befunde komplett sind:

Ich weiß, dass …

sich der Fluss geändert hat (Leck, Luft in der Pumpe)… weil die Peakfläche, aber kaum die Peakhöhe sich geändert hat

das Probelösungsmittel organischer ist als der Eluent/der Anfangsgradient… weil die frühen Peaks mit einem starken Fronting eluieren

der pH-Wert des Eluenten sich geändert hat oder – seltener – funktionelle Gruppen auf der stationären Phase hydrolysiert worden und dadurch nun mehr Silanolgruppen vorhanden sind … weil nur einige Peaks tailen und auch später eluieren – restliche Peaks sind OK

dass ich eine recht hydrophobe, endcappte, „klassische“ C18 stationäre Phase habe… weil eine derartige RP-Phase sehr ähnliche Komponenten (z. B. Isomere) nicht trennen kann

dass ich in der Probe entweder sehr große Moleküle oder sehr kleine, ionisch vorliegende Substanzen habe… weil solche Komponenten vor der Totzeit eluieren (Peaks vom letzten Lauf, Kontaminationen im Eluenten, Luft usw. können ausgeschlossen werden)

dass das Totvolumen der Apparatur zu groß im Vergleich zu dem Säulenvolumen ist…weil dies die einzige Ursache sein kann, dass bei neutralen Komponenten die Peaksymmetrie mit zunehmender Retention besser wird

— wenn es um das Erfassen aller Komponenten in der Probe geht, zusätzlich ein Universaldetektor wie z. B. CAD (Charge Aerosol Detector) benötigt wird… weil nicht alle Substanzen UV-aktiv sind bzw. ionisiert werden können

ich Methanol als organisches Lösungsmittel und niedrige Temperatur brauche …weil bei diesen Bedingungen polare Komponenten in der Regel besser zu trennen sind

meine Moleküle mit ausgewaschenen Metallionen aus allerlei Metalloberflächen Komplexe bilden bzw. dort teilweise adsorbiert werden… weil bei Verwendung von PEEK-Kapillaren, einer PEEK-lined Säule sowie einer Injektionsnadel aus PEEK oder Keramik die Peaksymmetrie wesentlich besser wurde

ich meine wässrige Probelösung mit 5-10% ACN oder Iso-OH versetzen sollte …weil durch diesen Zusatz in der wässrigen Probelösung die Adsorption der Analyte an allerlei Metalloberflächen in der HPLC-Apparatur (Physisorption, Adhäsion) verhindert bzw. minimiert wird

 

Trends in der HPLC

Von Allgemein, Detektor, Eluent, LC-MS-Kopplung, Optimierung

Trends in der HPLC Stavros Kromidas Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt. Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss. Highlight: Mehrdimensionale Trennungen Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken. Begründung: Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information…

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Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Von Allgemein, Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung des Chromatogramms

Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):           Katalytische Wirkung des Kieselgels Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit…

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Regulierter Bereich, feststehende Prüfvorschrift, geforderte Auflösung wird nicht erreicht – was ist möglich?

Von Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,…

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Nicht-endcappede Phasen – ein Auslaufmodell?

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps Demo, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, polare Komponenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall

In den letzten Jahren wurde eine Reihe moderner C18- sowie polarer RP-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappede sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell- oder monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl wäre? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als eine alte Technologie „ad acta“ legen?

Die Lösung

Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer Seitenkette (α, β-Isomerie, Stellungsisomerie) oder stark polare Komponenten sind Restsilanolgruppen für die Selektivität sehr wichtig. Dies wird an drei Beispielen demonstriert:

Beispiel 1: Trennung von Steroiden

Abb. 1: Trennung von drei Steroiden an zwei endcappeden (oben, Mitte) und an einer nicht endcappeden C18-Phase (unten), Erläuterungen siehe Text.

Das obere und mittlere Chromatogramm zeigen die Injektion von drei Steroiden (α, β-Isomere) an zwei modernen, hydrophoben Phasen. Steroid Nr. 2 und 3 koeluieren. Die Trennung gelingt an Resolve C18, einem älteren, nicht endcappeden Material, siehe unteres Chromatogramm in Abbildung 1.

Beispiel 2: Trennung von starken Basen

Abb. 2: Injektion einer Mischung von drei polaren Komponenten auf eine silanophile (links) und eine hydrophobe, endcappede C18-Phase (rechts), Erläuterungen, siehe Text.

Auf der rechten Seite der Abbildung 2 wird die Injektion von Uracil (inerte Komponente), Pyridin, Benzylamin und Phenol an einer modernen endcappeden C18-Säule gezeigt. Die zwei Basen koeluieren (erster Peak), was vollkommen nachvollziehbar ist: Man kann nicht erwarten, dass eine hydrophobe, gründlich endcappede Phase eine gute polare Selektivität aufweist. Und das kann zu falschen Schlussfolgerungen führen: Eine gute Peaksymmetrie suggeriert im Routinealltag eine gute Selektivität… Das linke Chromatogramm zeigt die Injektion auf eine „alte“, stark silanophile Phase, Hypersil ODS, das Ergebnis lautet: Eine hervorragende Selektivität für die zwei starke Basen bei gleichzeitig sehr langsamen Kinetik (starkes Tailing). Dass weitere polare Phasen wie beispielsweise eine C7-fluorierte Phase eine ebenso gute Selektivität aufweist (siehe mittleres Chromatogramm) versteht sich von selbst.

Beispiel 3: Injektion einer Mischung diverser Komponenten inkl. drei Isomeren (o-, m-, p-Toluidin) 

An mehreren Säulen von Waters erhält man nahezu das gleiche Bild, die Chromatogramme sehen recht ähnlich aus, für die drei Isomere ergeben sich zwei Peaks, siehe Pfeile in Abbildung 3. Erst beim Einsetzen einer nicht-endcappeden Phase (Abbildung 4) sind für die drei Isomere drei Peaks zu sehen. Ferner: Betrachte bei den letzten zwei Peaks die Elutionsumkehr. Auch hier: Eine fluorierte Phase (Abbildung 4, rechts) zeigt eine noch bessere polare Selektivität bei einer noch langsameren Kinetik, siehe dazu das auffallend starke Tailing.

Abb. 3 Trennung von polaren und apolaren Aromaten inkl. Stellungsisomeren, Erläuterung, siehe Text

Abb. 4 Trennung von polaren und apolaren Aromaten inkl. Stellungsisomeren, Erläuterung, siehe Text

Das Fazit

Für eine Vielzahl üblicher Trennprobleme sind moderne, endcappede Materialien zweifelsohne die richtige Wahl. Es gibt jedoch Fälle, in denen gerade Restsilanolgruppen eine Erhöhung der Selektivität bedingen. Das ist generell der Fall, wenn für die Selektivität zusätzliche Ionenaustausch-Wechselwirkungen notwendig sind wie beispielsweise bei Stellungsisomeren, Phospholipiden und starken Säuren/Basen. Eine evtl. suboptimale Peakform muss oft zu Gunsten einer guten polaren Selektivität in Kauf genommen werden. Es gilt folgende vereinfachte Regel: Je ähnlicher die Moleküle sind, umso notwendiger sind zusätzliche polare/ionische Wechselwirkungen für deren Trennung, umso langsamer die Kinetik bei der Desorption solcher Moleküle von der stationären Phase. Zur Auswahl und zum Vergleich von RP-Säulen siehe „Colona Vergleich und Auswahl von HPLC-RP-Säulen“ , ferner auch das Dokument „Einfache Tests zur Charakterisierung von HPLC-RP-Säulen“.

 

Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen/erniedrigen?  

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säule, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über folgenden Tatbestand unterhalten: Wenn ich in der HPLC einen physikalischen Parameter verändere, ist das Ergebnis selten eindeutig „gut“ oder „schlecht“. Je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen überwiegen Vor- oder eben Nachteile. Dies gilt analog auch für chemische Parameter. Hier wollen wir stellvertretend sechs solcher betrachten, siehe Tabelle 1. Die Lösung   Was Nachteile Vorteile Erhöhung der Temperatur In der Regel Abnahme der Selektivität und der Lebensdauer der Säule, ferner erhöhte Gefahr für  Zersetzung von thermolabiler Analyten Abnahme der Retentionszeit und des Druckes, Verbesserung der Peakform und dadurch Zunahme der Peakkapazität (Anzahl der…

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Zusätze in der Probelösung  

Von Auflösung, B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized

Der Fall Additiva (Modifier) oder einfache Zusätze wie Salze in der mobilen Phase können die Trennung positiv beeinflussen, ihr Einsatz bewährt sich seit Jahrzehnten. So kann beispielsweise die Peaksymmetrie und dadurch indirekt die Empfindlichkeit durch Verwendung von etwa Di- oder Triethylamin, DEA/TEA, Di-Tri- oder Fluoressigsäure, DFA/TFA/FA, Ionenpaarreagenzien wie Heptan- oder Oktansulfonsäure erhöht werden. Das Problem dabei: Solche Additiva werden teilweise an der Oberfläche der stationären Phase (irreversibel) adsorbiert, was in der Routine vielleicht ein geringe(re)s Problem darstellt. In der Methodenentwicklung jedoch ist dies störend, weil ja nach jedem Experiment die Säule mühsam durch Spülen wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht…

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Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Von Apparatur, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun…

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Das Totvolumen: Wie kritisch ist es wirklich? Und: Ist ein solches „schlimmer“ vor oder nach der Säule?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, Totvolumen

Der Fall Totvolumen ist das Volumen der Apparatur außerhalb der Säule in dem die Probe sich befindet; also, das Volumen vom Probengeber bis einschließlich Detektor – eben ohne Säule. Wir haben in unserer HPLC-Tipps-Reihe uns bereits mit dem Thema beschäftigt. Dennoch wird jenes insbesondere im Kontext mit Miniaturisierung und UHPLC weiterhin intensiv diskutiert, deswegen möchte ich es erneut aufgreifen. Wie wichtig, wie „schlimm“ ist das Totvolumen nun tatsächlich? Die Lösung Im aktuellen Tipp möchte ich wenig schreiben, dafür umso mehr Bilder zeigen. Merke direkt folgendes, was gleichzeitig bereits als Fazit der ganzen Diskussion gelten kann: Das Totvolumen ist wirklich wichtig…

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Wenn schon Druck, dann wenigstens so, dass es für Dich lohnt…

Von B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall UHPLC-Anlagen erlauben hohe Drücke. Solche ergeben sich, wenn beispielsweise eine lange oder eine dünne Säule und/oder kleine Teilchen verwendet werden oder aber wenn bei niedrigen Temperaturen gearbeitet wird. Mit dünnen Säulen wird eine gute Massenempfindlichkeit erzielt, eine niedrige Temperatur ist oft hilfreich bei der Trennung von Enantiomeren oder Isomeren. Wenden wir uns zunächst dem Ziel, „besser trennen“, zu. Nehmen wir an, in einem gegebenen Fall ist eine Verbesserung der Auflösung über die Selektivität kaum möglich, da unsere Probe zwei sehr ähnliche Komponenten enthält. Hier ist eine Verbesserung der Auflösung nur über eine höhere Bodenzahl zu realisieren, eine solche…

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