1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn 2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX) Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B….
Permanent auftretender Geisterpeak Faustregeln zu Log P und Log D Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache Seit kurzem erscheint ein Geisterpeak bzw. stets ein Blindwert im Blank… Seit einiger Zeit taugt bei einer Methode – oder bei mehreren – die noch vor kurzem keine Probleme machte(n), ein Geisterpeak auf. Oder aber, Sie haben in Ihrem Blank auf einmal stets einen Blindwert. Und dieses Problem haben Sie unabhängig von der Anlage, dem/der Anwender(in) und sogar der Methode. D.h. das übliche Fehler-Ausschluss-Programm haben Sie gründlich aber leider erfolglos absolviert. Versuchen Sie in einem solchen Fall im Team sich zu erinnern,…
Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,…
In den letzten Jahren wurde eine Reihe moderner C18- sowie polarer RP-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappede sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell- oder monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl wäre? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als eine alte Technologie „ad acta“ legen?
Die Lösung
Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer Seitenkette (α, β-Isomerie, Stellungsisomerie) oder stark polare Komponenten sind Restsilanolgruppen für die Selektivität sehr wichtig. Dies wird an drei Beispielen demonstriert:
Beispiel 1: Trennung von Steroiden
Abb. 1: Trennung von drei Steroiden an zwei endcappeden (oben, Mitte) und an einer nicht endcappeden C18-Phase (unten), Erläuterungen siehe Text.
Das obere und mittlere Chromatogramm zeigen die Injektion von drei Steroiden (α, β-Isomere) an zwei modernen, hydrophoben Phasen. Steroid Nr. 2 und 3 koeluieren. Die Trennung gelingt an Resolve C18, einem älteren, nicht endcappeden Material, siehe unteres Chromatogramm in Abbildung 1.
Beispiel 2: Trennung von starken Basen
Abb. 2: Injektion einer Mischung von drei polaren Komponenten auf eine silanophile (links) und eine hydrophobe, endcappede C18-Phase (rechts), Erläuterungen, siehe Text.
Auf der rechten Seite der Abbildung 2 wird die Injektion von Uracil (inerte Komponente), Pyridin, Benzylamin und Phenol an einer modernen endcappeden C18-Säule gezeigt. Die zwei Basen koeluieren (erster Peak), was vollkommen nachvollziehbar ist: Man kann nicht erwarten, dass eine hydrophobe, gründlich endcappede Phase eine gute polare Selektivität aufweist. Und das kann zu falschen Schlussfolgerungen führen: Eine gute Peaksymmetrie suggeriert im Routinealltag eine gute Selektivität… Das linke Chromatogramm zeigt die Injektion auf eine „alte“, stark silanophile Phase, Hypersil ODS, das Ergebnis lautet: Eine hervorragende Selektivität für die zwei starke Basen bei gleichzeitig sehr langsamen Kinetik (starkes Tailing). Dass weitere polare Phasen wie beispielsweise eine C7-fluorierte Phase eine ebenso gute Selektivität aufweist (siehe mittleres Chromatogramm) versteht sich von selbst.
Beispiel 3: Injektion einer Mischung diverser Komponenten inkl. drei Isomeren (o-, m-, p-Toluidin)
An mehreren Säulen von Waters erhält man nahezu das gleiche Bild, die Chromatogramme sehen recht ähnlich aus, für die drei Isomere ergeben sich zwei Peaks, siehe Pfeile in Abbildung 3. Erst beim Einsetzen einer nicht-endcappeden Phase (Abbildung 4) sind für die drei Isomere drei Peaks zu sehen. Ferner: Betrachte bei den letzten zwei Peaks die Elutionsumkehr. Auch hier: Eine fluorierte Phase (Abbildung 4, rechts) zeigt eine noch bessere polare Selektivität bei einer noch langsameren Kinetik, siehe dazu das auffallend starke Tailing.
Abb. 3 Trennung von polaren und apolaren Aromaten inkl. Stellungsisomeren, Erläuterung, siehe Text
Abb. 4 Trennung von polaren und apolaren Aromaten inkl. Stellungsisomeren, Erläuterung, siehe Text
Das Fazit
Für eine Vielzahl üblicher Trennprobleme sind moderne, endcappede Materialien zweifelsohne die richtige Wahl. Es gibt jedoch Fälle, in denen gerade Restsilanolgruppen eine Erhöhung der Selektivität bedingen. Das ist generell der Fall, wenn für die Selektivität zusätzliche Ionenaustausch-Wechselwirkungen notwendig sind wie beispielsweise bei Stellungsisomeren, Phospholipiden und starken Säuren/Basen. Eine evtl. suboptimale Peakform muss oft zu Gunsten einer guten polaren Selektivität in Kauf genommen werden. Es gilt folgende vereinfachte Regel: Je ähnlicher die Moleküle sind, umso notwendiger sind zusätzliche polare/ionische Wechselwirkungen für deren Trennung, umso langsamer die Kinetik bei der Desorption solcher Moleküle von der stationären Phase. Zur Auswahl und zum Vergleich von RP-Säulen siehe „Colona Vergleich und Auswahl von HPLC-RP-Säulen“ , ferner auch das Dokument „Einfache Tests zur Charakterisierung von HPLC-RP-Säulen“.
Der Fall Additiva (Modifier) oder einfache Zusätze wie Salze in der mobilen Phase können die Trennung positiv beeinflussen, ihr Einsatz bewährt sich seit Jahrzehnten. So kann beispielsweise die Peaksymmetrie und dadurch indirekt die Empfindlichkeit durch Verwendung von etwa Di- oder Triethylamin, DEA/TEA, Di-Tri- oder Fluoressigsäure, DFA/TFA/FA, Ionenpaarreagenzien wie Heptan- oder Oktansulfonsäure erhöht werden. Das Problem dabei: Solche Additiva werden teilweise an der Oberfläche der stationären Phase (irreversibel) adsorbiert, was in der Routine vielleicht ein geringe(re)s Problem darstellt. In der Methodenentwicklung jedoch ist dies störend, weil ja nach jedem Experiment die Säule mühsam durch Spülen wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht…
Der Fall Mithilfe von SSTs wird überprüft, ob diese Methode an diesem Gerät „hier und jetzt“ funktioniert. Ob also die Anforderungen an diese Methode erfüllt werden oder eben nicht. Als Forderung kann beispielsweise ein bestimmter Wert für die Auflösung eines kritischen Paars oder die Bestimmungsgrenze für eine Nebenkomponente gelten. Sind weitere Tests notwendig zumal ja die Zeit immer knapper wird? Die Lösung Sicherlich gibt es hier unterschiedliche Vorstellungen. Nachfolgend meine persönliche Meinung und davon ableitend ein Vorschlag: Ein gut designter SST beinhaltet die Information, die ich brauche. Passt er, so ist nichts mehr zu tun. Passt er nicht, so wären…
Der Fall Es gibt in der HPLC mehrere Möglichkeiten, die Peaks nach vorne zu schieben. Dabei rücken sie zusammen, die Auflösung nimmt natürlich ab. So lautet eine (vor)schnelle Schlussfolgerung. Das stimmt allerdings nicht immer. Wann nicht und warum? Die Lösung Betrachten wir hier ein klassisches RP-System. Ich kann die Wechselwirkungen zwischen Analyten und stationärer Phase wie folgt verringern, die Peaks eluieren dabei früher: Den organischen Anteil der mobilen Phase bzw. die Temperatur erhöhen, den pH-Wert verändern, schließlich kann ich eine polarere stationäre Phase verwenden. Wenn meine Substanzen nun sich chemisch ähneln und dementsprechend auch chromatographisch ähnlich verhalten – man spricht…
Herzlichen Glückwunsch an Dr. Marcus Hans! Marcus Hans hat die richtigen Antworten geliefert, seine kurzen Erklärungen sind sehr prägnant und werden nachfolgend nahezu wörtlich verwendet: Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das Totvolumen der Apparatur viel unwichtiger als das Verweilvolumen.Aussage ist korrekt; das Totvolumen nach der Säule ist viel wichtiger als jenes vor der Säule: So kann die Verbreiterung der Substanzbanden durch eine lange/dicke Kapillare, ein nicht richtig sitzendes Fitting oder ein großes Volumen der Messzelle die in der Säule erfolgte Trennung zunichte machen. Bei Gradiententrennungen dagegen ist das…
Der Fall Die wenigsten Anwender führen Säulentests durch – wenn doch, dann wird oft die Bodenzahl ermittelt, man interessiert sich für die Frage: „Ist die Säule noch „gut“?“. Die Mehrzahl führt eher einen Systemeignungstest (SST) durch, in diesem Fall ist die Säule ein Teil des „Gesamtsystems“. Dennoch kommen oft Fragen bzw. Zweifel auf, in etwa: „Reicht das, was wir machen?“ oder: „Wann ist die Säule nicht mehr zu gebrauchen?“ Mit diesen Fragen wollen wir uns hier beschäftigen. Die Lösung Säulentests können Informationen zu folgenden Attributen einer HPLC-Säule liefern: 1. Trennleistung (Sprich: Packungsqualität), 2. Eigenschaften der stationären Phase, 3. Selektivität/Eignung für…
Der Fall Ca. 70-80% der RP-Trennungen in der Routine sind Gradientenläufe. Den meisten Anwendern sind die Vorteile der Gradientelution geläufig, so z. B: Trennung von polaren und apolaren Komponenten in einem Lauf, merklich kürzere Trenndauer im Vergleich zu isokratischen Läufen, Erniedrigung der Bestimmungsgrenze und nicht zuletzt: Ein Übersichtsgradient ist ein hervorragender erster Schritt bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe. Was ist nun bei Gradiententrennungen grundsätzlich „anders“ im Vergleich zu isokratischen Trennungen? Die Lösung Isokratische und Gradiententrennungen stellen zwar keine gänzlich andere Welten dar, gibt es doch einige entscheidende Unterschiede. Nachfolgend greife ich stellvertretend zwei Unterschiede heraus. Interessierten Lesern sei auf…
