Trends in der HPLC Stavros Kromidas Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt. Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss. Highlight: Mehrdimensionale Trennungen Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken. Begründung: Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information…
Der Fall Sie konnten für bestimmte Probleme (Geisterpeaks, Tailing etc.) das/die vial(s) inkl. Inhaltes als Ursache identifizieren. Und dies obwohl an der Methode eigentlich „nichts“ geändert wurde. An was sollten Sie – auch – denken? Die Lösung Probleme können zunächst durch die Injektion selbst hervorgerufen sein. So kann beispielsweise die Injektionsnadel durch ein Septumpartikelchen oder Salzkriställchen teilweise verstopft sein; oder die Nadelspitze ist aufgrund eines harten (dunkelroten) Septums minimal verbogen; oder sind die Purgeflüssigkeit und/oder die Lösung im Waschvial schlicht alt; oder schließlich verhindert Luft in der Spritze/Injektionsnadel das Ansaugen des eingestellten Injektionsvolumens. Hier wollen wir uns jedoch nur auf das/die vial(s) bzw. sein Inhalt als Fehlerquelle konzentrieren. Nachfolgend sind einige Ursachen aufgeführt, die zu einem veränderten Chromatogramm führen können: Veränderung der Peakfläche bzw. Peakform, zusätzliche Peaks, Retentionszeitverschiebungen etc. Beispiele für Veränderungen der Probelösung Der pH-Wert Ihrer wässrigen Probelösung hat sich durch Silanolgruppen an der Oberfläche des vials geändert, diese Änderung kann innerhalb einer Stunde über eine pH-Wert-Einheit ausmachen. Es kann sein, dass bei einer langen Sequenz sich eine größere – da zeitabhängige – pH-Wert-Veränderung bei den letzten vials stärker bemerkbar macht; oder Sie haben eine neue Charge von vials eingesetzt deren Oberfläche acidere Silanolgruppen aufweist; oder die Probe bleibt…
Der Fall Vereinfacht gesagt, ist die Trennleistung – Effizienz, „Performance“, als Bodenzahl wiedergegeben – ein Maß für die Peakform. Eine große Bodenzahl bedeutet scharfe, symmetrische Peaks, eine geringe Bodenzahl dagegen breite, evtl. tailende Peaks. Warum ist die Peakform bei der Trennung großer Moleküle, z. B. Biomoleküle, besonders wichtig oder kritisch? Die Lösung Zunächst gilt es drei Punkte festzuhalten: In der Chromatographie ist die Auflösung (Resolution, R), also der Abstand zwischen zwei Peaks an der Basislinie, das wahrscheinlich aussagekräftigste Kriterium für die Güte einer Trennung Die Auflösung ist abhängig von der Kapazität (Stärke der Wechselwirkung, Maß: Retentionsfaktor k), von der Selektivität (unterschiedlich starke Wechselwirkungen zweier Substanzen, Maß: Trennfaktor α) und von der Trennleistung (Peakform, Maß: Bodenzahl, N) Ein wichtiger Trennmechanismus bei Biomolekülen (z. B. Proteine, monoklonale Antikörper) ist die Ausschlusschromatographie, SEC In der SEC basiert die Trennung auf unterschiedliche Molekülgrößen, eine Wechselwirkung findet definitionsgemäß gar nicht statt (sollte …). Somit entfallen bzgl. Auflösung hier zwei der drei möglichen Optimierungsparameter, nämlich Kapazität und Selektivität. Das bedeutet: Man kann in der SEC eine genügend gute Trennung nur über eine Verbesserung der Trennleistung, d.h. über die Peakform erzielen. Somit konzentrieren sich die Bemühungen bei der Optimierung einer SEC-Methode erstens auf die Unterbindung von Wechselwirkungen…
Liebe Leser:innen, zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023. Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen. Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches Symptom noch? Kommentar ∆ A + ∆ H 1. ∆ Injektionsvolumen 2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt) 3. ∆ Detektor 4. Instabile Probe 5. ∆ pH-Wert 6. ∆ Probekonzentration 5. ∆ Peakform 1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit 2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen) 3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle 5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen 6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe) ∆ H + ∆ tR, A = konstant 1. Eluent 2. ∆ stationäre Phase 3. ∆ Temperatur 1. ∆ P 3. ∆ P Stets: t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch ∆ Peakform…