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Methodentransfer

Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Von Allgemein, Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Methodentransfer, Monatstipp, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung des Chromatogramms

Geisterpeaks – aber erst „später“
Verbesserung der Empfindlichkeit

Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen

Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):

          Katalytische Wirkung des Kieselgels

  • Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit spät eluieren. Sind solche Substanzen in der Probe enthalten, so erscheinen evtl. Geisterpeaks. Fehlen diese Komponenten, eluieren nur Komponenten, die schwache Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen, die Geisterpeaks fehlen

    Verstärkt Hydrolyse durch ungewollte Veränderung chromatographischer Parameter
  • Stellen wir uns eine lange Sequenz vor: bei den gegen Ende der Sequenz zu injizierenden Proben herrscht im vial evtl. eine andere Temperatur als bei den Proben davor (z. B. Temperaturdifferenz Kühlschrank-Probengeber oder Temperaturgradient im Probenraum des Probengebers)
  • Auch folgendes wäre im Falle einer langen Sequenz denkbar: der pH-Wert im vial ändert sich mit der Zeit – aus welchen Gründen auch immer – und ab einem bestimmten pH-Wert sind allerlei Veränderungen der Probe denkbar und somit erscheinen zusätzliche Substanzen erst nach einer gewissen Zeit

    Oxidationsprodukte
  • Man/frau arbeitet mit Tetrahydrofuran (THF) in der mobilen Phase; ein Blindgradient zu Beginn zeigt keine Probleme. Mögliche Peroxide aus dem THF sammeln sich allerdings erst mit der Zeit an der Säule und erscheinen nach einer Zeit X als Geisterpeaks gegen Ende des Gradienten. Man/frau wundert sich wieso erst nach so und so vielen Stunden bei den Nachtläufen Geisterpeaks auftauchen…
  • Trotz sicherlich Endreinigung der Dichtungen vor Auslieferung, kann eine Rest-Fettschicht auf deren Oberfläche vorhanden sein. Deren Oxidationsprodukten (z. B. N-Oxide) können als Geisterpeaks erscheinen, die Anzahl und der Zeitpunkt kann von der Arbeitsweise abhängig sein: Anzahl der Läufe, Temperatur, Eluent, Zusammensetzung der mobilen Phase bei der Lagerung usw.Auffüllen des Vorratsgefäßes
  • In Acetonitril können Polymere entstehen. Wird das Vorratsgefäß stets aufgefüllt sobald ca. die Hälfte des Lösungsmittels aufgebraucht ist, gibt es keine Probleme, deren Konzentration ist gering. Erfolgt das Auffüllen nicht immer zum gleichen Zeitpunkt, kann passieren, dass bei geringer Flüssigkeitsmenge im Vorratsgefäß die Polymer-Konzentration derart hoch ist, dass neben „Wellen“ in der Basislinie auch Geisterpeaks erscheinen. Also frei nach Giovanni Trapattoni: „Flasche voll: Keine Probleme, Flasche (fast) leer: Probleme

Verbesserung der Empfindlichkeit

Über das Thema haben wir uns an dieser Stelle bereits mehrfach unterhalten. Da es wichtig ist, möchte ich weiter unten die aus meiner Sicht effektivsten Maßnahmen verdichtet zusammenfassen. Das Ziel lautet: Möglichst große, schmale, symmetrische Peaks.

  1. Optimale Bedingungen bezüglich Hard- und Software:
  • *Geringes Dispersionsvolumen (vereinfacht: Totvolumen)
  •   Notwendig bei bestimmten Analyten: Inerte/Bio-inerte/Metall-freie Anlage und inerte bzw. Peek-ummantelte Säule,    silanisierte vials
  • *Falls möglich, mit Luftsegmenten zwischen Probengeber und Säule arbeiten, um eine Verdünnung der Substanzzone
    zu verhindern
  • *Optimale Settings, z. B. mindestens 40 Datenpunkte, 16 nm Spalt, 50 ms Zeitkonstante, Rauschen-Unterdrückung
  •   Je nach verwendeter Detektionsart und Analyt-Stabilität das technisch maximal Machbare nutzen, z. B: Max-
    Light/LightPipe (UV), Triple Quad MS (LC-MS), ICP-MS
  1. Chromatographische Parameter:
  • Nach Möglichkeit kurze, in jedem Fall dünne Säulen; wenn die Voraussetzungen gegeben sind, evtl. auch an Kapillaren denken
  • Core Shell- (1,3-1,7 µm) oder falls es porös sein muss, Sub2µm-Material
  • *Stets schwächeres Probelösungsmittel im Vergleich zum Anfangsgradienten verwenden: Anreicherung der
    Substanzzone am Säulenkopf; ggf. mit Hilfe eines Schaltventils Anreicherung in einer Trap-Säule in Erwägung ziehen
  • *Steiler Gradient mit 30-40 % B beginnend
  • *Bei thermostabilen Komponenten tendenziell bei höheren Temperaturen chromatographieren

Die mit „*“ versehenen Maßnahmen sind relativ schnell umzusetzen, der Rest ist mit einem gewissen Aufwand verbunden, der Nutzen kann nur individuell bewertet werden.

Sprechen wir alle die gleiche „Sprache“? (III)

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps Demo, Methodentransfer, Systemeignungstest (SST)

Sprechen wir alle die gleiche „Sprache“? (III)

In diesem und in diesem Tipp haben wir uns über Probleme unterhalten, die dadurch entstehen, dass unter bestimmten Begriffen etwas Anderes verstanden wird. Oder aber auch, wenn ähnlich klingende Begriffe etwas Anderes bedeuten. Derartige Missverständnisse gibt es zur Genüge, deswegen greife ich das Thema noch einmal auf. Ich beschränke mich heute auf vier Beispiele in Regelwerken, also Infos, die an AnwenderInnen im regulierten Umfeld adressiert sind.

Systemeignungstest (System Suitability Test, SST)

In der USP steht: „The tests are based on the concept that the equipment, electronics, analytical operations, and samples analyzed constitute an integral system that can be evaluated as such”

Im gleichen Abschnitt etwas weiter steht allerdings auch: “These system suitability tests are performed by collecting data from replicate injections of standard or other solution as specified”

Diese, beide existierenden Aussagen führen dazu, dass in einem Labor für einen SST „samples“, also reale Proben, z. B. Wirkstoff plus Placebo, verwendet werden, in einem anderen Labor jedoch lediglich Standards. Die Ergebnisse sind dabei nicht immer vergleichbar, weil jene (Peakfläche, Peakform, Präzision) evtl. von der Matrix beeinflusst werden.

Und noch ein Detail in diesem Zusammenhang: In der JP ist der Text im Prinzip identisch mit dem Text in der USP (siehe weiter oben) jedoch mit dem Zusatz „operators“(!): „…and based on the concept that the equipments, electronic data processing systems, analytical operations, samples to be analyzed and operators constitute an integral system that can be evaluated“.

Temperatur

Gerade bzgl. „Temperatur“ gibt es in Regelwerken abweichende Definitionen, nachfolgend einige Beispiele zu „kalt“:

EP     : Cold or cool: 8°C to 15°C
USP  : Cold: Any temperature not exceeding 8°C
Cool: Any temperature between 8° and 15°C
JP     : Cold: 1°C – 15°C
WHO: Cool: Store between 8°-15°C

Ferner: Der Terminus “Standard Temperature” wird nur von der JP (20°C) und „Ambient Temperature“ nur von der WHO (between 15° to 25°C) verwendet.

Nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über die Temperaturbereiche in einzelnen Regelwerken wider. 

„In“ vs. „to“

In der Prüfvorschrift einer Monographiemethode steht: „…Disolve 100 g X to 1000 ml demin. water…“. Etwas weiter unten im Text steht: „…Disolve 2,8 g Y in 1000 ml demin. water and adjust to pH 4.5 with…“.
Verstehen alle AnwenderInnen dieser PV das gleiche bei diesen Angaben, wird die mobile Phase/die Probelösung auf der gleichen Art und Weise angesetzt, zumal es sich einmal um Feststoff und einmal um Flüssigkeit handeln kann?

„Relative Retention“ vs. „Relative Retention Time”

In der USP ist einmal die Rede von „Relative Retention (r)“ und einmal von „Relative Retention Time (RRT)“ („unadjusted relative retention“). Im ersten Fall handelt es sich um den Quotienten aus zwei Retentionszeiten, normiert um die Totzeit tM, r = tR2 tM/tR1 tM. Im zweiten Fall lediglich um den Quotienten aus zwei Retentionszeiten RRT = tR2/tR1 .

Diese ähnliche klingende Größen können Verwirrung stiften: Bei „Relative Retentionszeit“ bezieht man beispielsweise die Retentionszeit einer Verunreinigung auf die Retentionszeit der Hauptkomponente, um gerade diese Verunreinigung zu identifizieren. Dies ist zwar eine übliche Praxis (USP: “Comparisons in USP are normally made in terms of unadjusted relative retention”) jedoch problematisch, denn: Ich beziehe eine Variable (Retentionszeit der Nebenkomponente) auf eine andere Variable (Retentionszeit der Hauptkomponente), weil ja auch die Retentionszeit der Hauptkomponente sich durch Änderung der Eluentenzusammensetzung oder des pH-Wertes oder der Temperatur selbstverständlich ändern kann. Die Verwendung der relativen Retention (Retentions- oder Kapazitätsfaktor, k) macht aus chromatographischer Sicht mehr Sinn: Durch die Division mit der Totzeit, tM, normalisiere ich, weil ich mich auf eine Zeit beziehe – eben tM  –, die definitionsgemäß von stationärer und mobiler Phase inkl. pH-Wert sowie Temperatur nicht beeinflusst wird. Ich beziehe eine Variable (Retentionszeit von X) auf eine Konstante (Totzeit, also Retentionszeit einer inerten Komponente), Ergebnis: Die relative Retention (Retentionsfaktor k) ist zur Identifizierung einer Komponente bei konstanten chromatographischen Bedingungen sicherer als die relative Retentionszeit.

Fazit:
Wenn es um Entscheidungen geht, steht oft sinnvollerweise die Vergleichbarkeit von Ergebnissen im Vordergrund, die „Richtigkeit“ von absoluten Zahlen ist häufig von untergeordneter Bedeutung, da Richtigkeit oft unbekannt. Um dies zu gewährleisten bedarf es der gleichen „Sprache“ und der exakt gleichen Anwendung von Tools und Größen.

 

Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Von Apparatur, B Optimierung, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die…

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Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)…

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Warum kann manchmal eine „zu gute“ Präzision beim Methodentransfer hinderlich sein?

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Variationskoeffizient (Vk)

Von Mike Hillebrand, Aventis Der Fall Ein Baustein des Methodentransfers ist die „Intermediate Precision“ (Laborpräzision). Dabei werden in beiden Laboratorien, dem aufnehmenden und dem abgebenden, Vergleichsanalysen mit der validierten, zu transferierenden Methode durchgeführt. Diese sollen sicherstellen, dass das empfangende Laboratorium in der Lage ist, die neue implementierte Methode anzuwenden. Dadurch ist eine vollständige Validierung der Methode im empfangenden Laboratorium nicht nötig. Das Design der „Intermediate Precision“ richtet sich nach dem Analyseverfahren, welches es zu transferieren gilt. Beispielsweise wird für eine Gehaltsbestimmung häufig ein Design verwendet, bei dem zwei Mitarbeiter pro Labor zum Einsatz kommen. Ziel ist das Prüfen einer Charge….

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Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden III

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Verweilvolumen

Im zweiten Teil der kleinen Tipps-Serie zum Methodentransfer von HPLC-Methoden hat Mike Hillebrand auf fehlende Infos beim Methodentransfer hingewiesen. Fehlende Infos dürften in der Tat eine der häufigsten Ursachen für missglückte Methodentransfers sein. Im dritten und letzten Tipp zu diesem Thema greife ich daher diese Problematik erneut auf, dabei beschränke ich mich auf zwei Felder Themen: Beispielhaft werden weiter relevante Informationen bzgl. Hardware sowie „Probe auflösen“ genannt, die leider nicht immer weitergegeben werden. Diese Liste ist natürlich beliebig erweiterbar. Wichtige Infos, die die HPLC-Anlage betreffen – gleiche Anlage, anderes Ergebnis Man verwendet eine baugleiche Gradientenanlage und geht folglich davon aus, dass…

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Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden II

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodentransfer

Von Mike Hilebrand, Aventis „Fallstricke im HPLC-Methodentransfer – Verwendete Materialien und Equipment “ Fall 1: Beim Methodentransfer erhält das aufnehmende Labor durchweg niedrigere Gehaltswerte als das abgebende Labor. Es handelte sich um ein Produkt mit sehr niedriger Konzentration. Lösung zu Fall 1: Nach längerer Ursachenforschung wurde erkannt, dass das aufnehmende Labor einen anderen Vial-Typ verwendet als das abgebende Labor. Das abgebende Labor verwendet schon immer standardmäßig PP-Vials. Das aufnehmende Labor Vials aus Glas. Das Produkt weist in niedrigen Konzentrationen starke Adsorptionseffekte auf. Durch Verwendung von PP-Vials wurde die Adsorption verhindert. Da das Molekül negativ geladen ist, wird es durch die…

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Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden I

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodentransfer

Von Mike Hilebrand, Aventis Der Fall Nachdem wir als Analytiker eine analytische Methode entwickelt und validiert haben, ist es häufig der Fall, dass wir im Rahmen der Produktetablierung die Methode in andere Laboratorien transferieren müssen. Dies können sowohl interne als auch externe Laboratorien sein. Das Ziel dabei ist es, die Kollegen des aufnehmenden Labors in die Lage zu versetzen, die Methode so durchzuführen, dass dabei identische Ergebnisse wie im abgebenden Labor generiert werden. Man erspart sich damit eine Validierung der Methode im aufnehmenden Labor. Idealerweise sollte es ausreichen, die festgeschriebene Prüfanweisung an das aufnehmende Labor zu übergeben und zu schulen….

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Die „Kleinen“ im Sommer …

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Methodentransfer, polare Komponenten, Uncategorized

„Was sollte ich denn machen, die hatten nur Vodka…“ Folgende Anekdote eines Kollegen aus den Anfängen der HPLC: Er war um 1980 herum in der Sowjetunion auf Kundenreise. Im tiefsten Sibirien angekommen, wollte er nach einem Kundengespräch als Beleg für das Besprochene auch ein paar praktische Versuche durchführen – manch einer war logischerweise etwas misstrauisch gegenüber Versprechungen aus dem Westen… Damals war es mit dem Zoll noch schwieriger als heute, er konnte gerade zwei Säulen dabei haben, es waren je eine 25 cm lange Spherisorb C8 bzw. Spherisorb CN. Mit MeOH und ACN war natürlich „nichts“, aber Vodka, davon war…

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Modernes HPLC/UHPLC gekauft, dennoch unzufrieden – warum? II

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass an einem modernen HPLC/UHPLC-Gerät Peakform, Auflösung und Empfindlichkeit im Vergleich zu einem älteren Gerät womöglich zu wünschen übrig lassen. Heute wollen wir mögliche Gründe für die zwei letztgenannten Fälle ausfindig machen. Die Lösung Schlechtere Trennung an modernen Geräten Moderne HPLC/UHPLC-Geräte weisen im Vergleich zu älteren Geräten ein wesentlich kleineres Verweilvolumen auf, Verweilvolumen = Dwell- oder Delayvolume: Volumen von der Mischkammer/dem Mischventil bis zum Säulenkopf. Das Verweilvolumen wiederum beeinflusst beim Gradienten u.a. auch die Auflösung nach dem Motto: Δ Verweilvolumen oft Δ Auflösung. Und hier liegt der „Hund begraben“: Kleines…

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