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Totvolumen

Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Monatstipp, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen,

zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.

Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.

In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.

 

Änderung (Symptom)Ursache(n)Welches Symptom noch?Kommentar
∆ A + ∆ H1. ∆ Injektionsvolumen

2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt)
3. ∆ Detektor

4. Instabile Probe

5. ∆ pH-Wert

6. ∆ Probekonzentration

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ∆ Peakform

1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit
2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen)
3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle
5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen
6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR,
A = konstant
1. Eluent
2. ∆ stationäre Phase
3. ∆ Temperatur
1. ∆ P

 

 

3. ∆ P

Stets:
t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel
auch
∆ Peakform

1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H,
A = konstant
∆ PackungsqualitättR = konstant,

Verschlechterung der Peakform

∆ tR, ∆ t0, ∆ A,
H = fast konstant
∆ Fluss∆ P Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform –
alle Peaks
 

1. Totvolumen
2. Verschlechterung der Packungsqualität

 

tR = konstant

Schlechte Peakform –
einige Peaks
∆ pH-WertBetroffene Peaks: ∆ tREtwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks1. Hohlraum im Packungsbeet
2. Verbogene Injektionsnadel
3. Substanz liegt in zwei Formen vor
 

 

3. pH-Wert minimal verändern

 

 

Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, Jahrestipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz (∆ Peakfläche, ∆ Peakform) Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform) Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare…

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Regulierter Bereich, feststehende Prüfvorschrift, geforderte Auflösung wird nicht erreicht – was ist möglich?

Von Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,…

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Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Von Apparatur, B Optimierung, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die…

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Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Von Apparatur, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun…

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Das Totvolumen: Wie kritisch ist es wirklich? Und: Ist ein solches „schlimmer“ vor oder nach der Säule?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, Totvolumen

Der Fall Totvolumen ist das Volumen der Apparatur außerhalb der Säule in dem die Probe sich befindet; also, das Volumen vom Probengeber bis einschließlich Detektor – eben ohne Säule. Wir haben in unserer HPLC-Tipps-Reihe uns bereits mit dem Thema beschäftigt. Dennoch wird jenes insbesondere im Kontext mit Miniaturisierung und UHPLC weiterhin intensiv diskutiert, deswegen möchte ich es erneut aufgreifen. Wie wichtig, wie „schlimm“ ist das Totvolumen nun tatsächlich? Die Lösung Im aktuellen Tipp möchte ich wenig schreiben, dafür umso mehr Bilder zeigen. Merke direkt folgendes, was gleichzeitig bereits als Fazit der ganzen Diskussion gelten kann: Das Totvolumen ist wirklich wichtig…

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Peaky und Chromy – die „HPLC-Versteher“? (die Antworten)

Von Apparatur, Auflösung, Detektor, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Vorsäule, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Herzlichen Glückwunsch an Dr. Marcus Hans! Marcus Hans hat die richtigen Antworten geliefert, seine kurzen Erklärungen sind sehr prägnant und werden nachfolgend nahezu wörtlich verwendet: Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das Totvolumen der Apparatur viel unwichtiger als das Verweilvolumen.Aussage ist korrekt; das Totvolumen nach der Säule ist viel wichtiger als jenes vor der Säule: So kann die Verbreiterung der Substanzbanden durch eine lange/dicke Kapillare, ein nicht richtig sitzendes Fitting oder ein großes Volumen der Messzelle die in der Säule erfolgte Trennung zunichte machen. Bei Gradiententrennungen dagegen ist das…

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Peaky und Chromy – die „HPLC-Versteher“? (die Fragestellungen)

Von Apparatur, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Vorsäule, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen möglicherweise fehlt auch Ihnen bei Diskussionsrunden schwer, Aussagen von Fachleuten zu beurteilen. Umso mehr, wenn sie sogar wahrhaftig erscheinen… Lasst uns nun zwei Fachleuten lauschen – sofern sie tatsächlich welche sind: Unseren Peaky und Chromy. Peaky fängt an – wie sollte es auch anders sein – aber Chromy will nicht zurückstecken und im Anschluss präsentiert auch er seine Aussagen. Wenn Sie möchten, überlegen Sie sich welche Aussagen richtig sind. Hier geht es zu den richtigen Antworten. Viel Erfolg! Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, Totvolumen, Uncategorized

Resultierender Druck „Fuß“ am Peakende Core Shell (Fused Core)-Material Wann ergibt sich welcher Druck? Bei einer Änderung der Dimensionierung von Säulen bzw. Kapillaren sowie der Teilchengröße ändert sich der Druck. Nahezu alle Hersteller bieten EXCEL-Makros an, mit deren Hilfe der sich ergebende Druck bei einer Änderung von… rechnerisch ermittelt wird. Dennoch möchte ich hier gerne anhand einiger Zahlenbeispiele auf 1-2 Sachen hinweisen, um anschließend zu einem Resultat zu kommen. Merke: Der Druck verhält sich mit der Säulenlänge linear, mit dem Innendurchmesser der Säule sowie dem Teilchendurchmesser quadratisch und mit dem Innendurchmesser einer Kapillare in der vierten Potenz. Das heißt beispielsweise:…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Totvolumen, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der…

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