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Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Monatstipp, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen,

zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023.

Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt.

In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.

 

Änderung (Symptom)Ursache(n)Welches Symptom noch?Kommentar
∆ A + ∆ H1. ∆ Injektionsvolumen

2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt)
3. ∆ Detektor

4. Instabile Probe

5. ∆ pH-Wert

6. ∆ Probekonzentration

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ∆ Peakform

1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit
2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen)
3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle
5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen
6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe)
∆ H + ∆ tR,
A = konstant
1. Eluent
2. ∆ stationäre Phase
3. ∆ Temperatur
1. ∆ P

 

 

3. ∆ P

Stets:
t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel
auch
∆ Peakform

1. Falls ∆ pH-Wert des Eluenten, evtl. auch ∆ A
∆ H,
A = konstant
∆ PackungsqualitättR = konstant,

Verschlechterung der Peakform

∆ tR, ∆ t0, ∆ A,
H = fast konstant
∆ Fluss∆ P Leck, Luft in der Pumpe
Schlechte Peakform –
alle Peaks
 

1. Totvolumen
2. Verschlechterung der Packungsqualität

 

tR = konstant

Schlechte Peakform –
einige Peaks
∆ pH-WertBetroffene Peaks: ∆ tREtwas seltener: Instabile Analyte, dadurch evtl. zusätzliche Peaks
Doppelpeaks1. Hohlraum im Packungsbeet
2. Verbogene Injektionsnadel
3. Substanz liegt in zwei Formen vor
 

 

3. pH-Wert minimal verändern

 

 

Woher kommt das?

Von A Fehlersuche, Bodenzahl, Detektor, Fluss, Injektionsvolumen, Jahrestipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Pumpe, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Typischen Symptomen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden; oder aber die Zahl der infrage kommenden Ursachen kann durch Beurteilung der Symptome („Welche Veränderung kann dieses Symptom bedingen und welche definitiv nicht?“) wenigstens eingegrenzt werden. Nachfolgend werden beispielhaft sieben häufige „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. Bei Bedarf erfolgt auch ein Kommentar. Für die vorgestellten Fälle gelten folgende Annahmen: Keine bewusste Änderung seitens der Anwender:innen, z. B. es wurde keine längere Säule eingebaut Es handelt sich vorwiegend um RP-Trennungen mit einem konzentrationsempfindlichen Detektor wie beispielsweise UVVis, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor Weiter unten sind die häufigsten Ursachen genannt Symbole: ∆: Änderung H: Peakhöhe A: Peakfläche T: Temperatur P: Druck c: Konzentration tR: Retentionszeit t0: Totzeit (Front, Injektionspeak) In der Tabelle weiter unten befindet sich auch die Spalte „Welches Symptom noch?“. Sie ist leer. Liebe Leser:innen, es könnte sein, dass Sie um den Jahreswechsel herum ein wenig Zeit haben … Sollte dies der Fall sein und Sie Lust verspüren, könnten Sie sich überlegen, welches Symptom zum jeweiligen Fall zusätzlich „passt“, also: Welcher Parameter bleibt zusätzlich konstant, welcher ändert sich noch? Im ersten Tipp des Jahres 2023 werden Sie dort manches finden. Ich wünsche Ihnen ein friedliches Fest und viel Spaß!   Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches…

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Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Jahrestipps, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage? Die Lösung Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind. Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen: Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem rechtzeitig zu erkennen, ob also Gefahr für Niederschlag besteht (Tipp von Jens Braun, BioChem): Probelösung einfach kalt machen und anschließend zentrifugieren Temperatur zum Zweiten: Bessere Peakform, Zunahme der Peakfläche Wenn die Standard-/SST-lösung organischer als der Eluent/Anfangsgradient ist, entsteht Fronting, mitunter bei sehr frühen Peaks auch „Buckel“. Wenn nun aus jener Lösung im Laufe der Sequenz häufig injiziert wird, kann das organische Lösungsmittel u.U. verdampfen, Ergebnis: Aufkonzentrierung der Probe im Vial, die Peakfläche nimmt zu und dadurch, dass nun die Probelösung womöglich „Eluent-ähnlicher“ geworden ist, ergibt sich eine Verbesserung der Peakform Temperatur zum Dritten: Zunahme der Peakfläche und/oder größerer Variationskoeffizient Eine…

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Gründe für eine Verschiebung des pH-Wertes

Von A Fehlersuche, Jahrestipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten

Der Fall Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert des Eluenten, er driftet ins Alkalische, z. B: pH-Wert eines wässrigen Phosphatpuffers, 2,2, nach der Zugabe von 70 % Methanol ergibt sich ein „pH-Wert“ von ca. 4,0, nach der Zugabe von 70 % Acetonitril von ca. 3,0 Es wird der falsche Puffer verwendet, also ein Puffer, der im betreffenden pH-Wert-Bereich keine Pufferwirkung aufweist, z. B. Acetatpuffer bei einem eingestellten pH-Wert von 3,0 Es wird lediglich ein Salz und kein Puffer verwendet; oder aber man/frau spricht von „Puffer“, aber es wird lediglich angesäuert (z. B. 0,1 % TFA, Trifluoressigsäure) Der verwendete Puffer ist recht schwach; so hat man/frau nicht die Gewähr,…

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Zwei kleine Sommer-Tipps

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, Bodenzahl, Injektionsvolumen, Jahrestipps, kleine Peaks, Probengeber

Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen „Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse Temperatur   Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen? Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei 10 °C Abb. 1 Unterschiedliche  Beeinflussung von Selektivität und Retentionszeit bei einer Änderung der Temperatur, Details, siehe Text Die Trennleistung (= Effizienz), also letzten Endes die Peakform, kann sich bei einer Temperaturerhöhung um ca. 4 °C, T1 auf T2, nur minimal (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Val-Phase“, Abbildung 2) oder auch merklich verbessern (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Pro-Phase“, Abbildung 2). Das Ausmaß ist demnach abhängig – auch von der Säule   Abb. 2 Abhängig von der Säule, merkliche oder geringe Verbesserung der Peakform bei einer Temperaturerhöhung, Details, siehe Text Selbes Gerät, unterschiedliche Ergebnisse An einem qualifizierten und technisch einwandfreien…

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Die „Kleinen“ im Sommer …

Von Allgemein, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Jahrestipps, Probenlösungsmittel

1. „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn 2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen   „Schwach“ ist oft effektiver – im positiven oder im negativen Sinn An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX) Mit einer schwachen Probelösung(im RP-Modus: Jene einfach mit Wasser verdünnen oder mit Neutralsalz versetzen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung, vor allem bei früh eluierenden Peaks Analog die mobile Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Pufferreich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B. 70/30 Iso-OH/Wasser) ist zum Entfernen von Mikroorganismen effektiver als beispielsweise eine starke, z. B. eine 90 oder 100 % Iso-OH-Lösung. So auch mit Wasserstoffperoxid: Eine 3 % ige H2O2-Lösung ist effektiver als z. B. eine 10 % -ige Substanzen bleiben aus schwach-konzentrierten Probelösungeneher als aus stärker-konzentrierten durch Adhäsion oder Physisorption an allerlei Oberflächen „hängen“ (Memory-Effekt)        2. Auflösung bei einer RP-Trennung nicht vorhanden – effektive Maßnahmen Vorbemerkung: Der Einfachheit halber unterstellen wir hier einen isokratischen Lauf, die Aussagen gelten jedoch grundsätzlich auch für Gradientenläufe. Folgender fiktiver Fall: Die Effizienz Ihrer Säule beträgt 10.000 Böden, bei den aktuellen chromatographischen Bedingungen…

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Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, Jahrestipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz (∆ Peakfläche, ∆ Peakform) Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform) Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare…

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Peaky und Chromy beim Denksport

Von Allgemein, Jahrestipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung: „Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“ „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern. „Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen Peak liefert?“ „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“ Schlechte Packungsqualität und Totvolumen sind Substanz-unspezifische Problemquellen. Liegt eine solche vor, so ergibt sich stets – unabhängig von der Natur der injizierten Komponente – eine schlechte Peakform. „Warum müssen die Substanzen in dieser Probe stark polar sein?“ „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“Wenn trotz geringer Konkurrenz um die Gunst der C18-Borsten seitens der Moleküle in der…

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Peaky & Chromy beim Denksport

Von Allgemein, Jahrestipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky ist wegen der doch sehr lange anhaltenden Pandemie und dem speziellen Jahresstart immer noch richtig „aufgekratzt“, er lässt den armen, gemütlichen Chromy – nach einem schnellen, obligatorischen „Ein gutes, neues Jahr 2022“ – einfach nicht in Ruhe. Chromy bleibt nichts anderes übrig als auf ihn einzugehen, er kann ja später mit den C18-Borsten weiter flirten. Peaky: Du Chromy, wir wollen etwas spielen, OK? Und weil Du sooo gescheit bist, sollst Du Dich etwas anstrengen. Also: Ich präsentiere Dir Antworten und Du sollst Dir eine vernünftige, passende Frage überlegen. Und hör mal: Ich habe nicht so viel Zeit, die Silanole warten schon auf mich, also denk´ ratzfatz. Er setzte sein schelmisches Lächeln auf und legte los: „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“ „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“ „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“ „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“ „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate…

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HPLC und Politik? Aber ja doch …

Von Allgemein, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

HPLC ist ein flexibles, leistungsfähiges Tool und findet vielfach Verwendung, man/frau denkt gar nicht wo überall. HPLC und Politik? Aber ja doch … Viele von uns betreiben HPLC (High Pleasure Liquid Chromatography). Wichtige Dinge finden nun – manchmal – Einzug in die Politik. So auch die HPLC mit ihren Varianten. Ob allerdings das Prinzip der HPLC von allen PolitikerInnen richtig verinnerlicht wurde? Ich weiß nicht so recht … Wichtige HPLC-Modi in der Politik Einige betrieben HPLC lange Zeit mehr schlecht wie recht (Huge Problems, Little Creativity), jetzt sind sie lediglich Verwalter (Happy Professionals Lame Champions). Bei einigen Neulingen habe ich meine Bedenken ob hinter glänzenden, inerten Oberflächen auch gute Spezifikationen schlummern (High Potential Low Charge). Einige PolitikerInnen wiederum sind auf der Höhe der Zeit und bringen die Umwelt-Diskussion forsch voran (High Promises for Low Carb). Diversität der HPLC und Ziele Schwierige, seltene Trennprobleme in der Analytik bedürfen bekanntlich speziellen Säulen (Porous Layer Open Tube Columns). Fehlt jedoch das entsprechende Know How, ist das Ergebnis in Analytik und Politik ernüchternd (Problems, Little Output, Total Chaos). Wirklich schwierige Fälle sind allerdings eher selten, das (HPLC)Volk interessiert sich alltäglich für klassische UHPLC-Themen (Umweltverschmutzung, Heizung, Preise, Lieferketten, Coronabekämpfung). Und in der Politik? Klassisch-attraktive UHPLC-Schwerpunkte…

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