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Geisterpeaks & negative Peaks

Wenn die Probleme aus dem vial kommen …

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, Injektionsvolumen, Monatstipp, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung des Chromatogramms

Der Fall

Sie konnten für bestimmte Probleme (Geisterpeaks, Tailing etc.) das/die vial(s) inkl. Inhaltes als Ursache identifizieren. Und dies obwohl an der Methode eigentlich „nichts“ geändert wurde. An was sollten Sie – auch – denken?

Die Lösung

Probleme können zunächst durch die Injektion selbst hervorgerufen sein. So kann beispielsweise die Injektionsnadel durch ein Septumpartikelchen oder Salzkriställchen teilweise verstopft sein; oder die Nadelspitze ist aufgrund eines harten (dunkelroten) Septums minimal verbogen; oder sind die Purgeflüssigkeit und/oder die Lösung im Waschvial schlicht alt; oder schließlich verhindert Luft in der Spritze/Injektionsnadel das Ansaugen des eingestellten Injektionsvolumens. Hier wollen wir uns jedoch nur auf das/die vial(s) bzw. sein Inhalt als Fehlerquelle konzentrieren. Nachfolgend sind einige Ursachen aufgeführt, die zu einem veränderten Chromatogramm führen können: Veränderung der Peakfläche bzw. Peakform, zusätzliche Peaks, Retentionszeitverschiebungen etc.

  1. Beispiele für Veränderungen der Probelösung
  • Der pH-Wert Ihrer wässrigen Probelösung hat sich durch Silanolgruppen an der Oberfläche des vials geändert, diese Änderung kann innerhalb einer Stunde über eine pH-Wert-Einheit ausmachen. Es kann sein, dass bei einer langen Sequenz sich eine größere – da zeitabhängige – pH-Wert-Veränderung bei den letzten vials stärker bemerkbar macht; oder Sie haben eine neue Charge von vials eingesetzt deren Oberfläche acidere Silanolgruppen aufweist; oder die Probe bleibt eine längere Zeit im vial, da der Probengeber aufgrund einer kleinen Reparatur eine Stunde lang nicht im Betrieb war
  • Die Probe bzw. die Matrix ist vielleicht doch ein wenig „anders“ als bei der letzten Messung, z. B. die Produktion/Galenik hat das Herstellungsverfahren/die Formulierung minimal geändert und diese „unwichtige“ Info wird dem Labor nicht übermittelt. Analog auch eine kleine Veränderung des Packmittels: Neue Bestandteile darin diffundieren in die zu analysierende Probe. Eine biologische oder Umweltprobe weist natürliche Schwankungen auf, z. B. war der Sommer eher trocken oder eher nass (Milch, Pflanzensaft, Tabak), erfolgt die Blutentnahme wirklich zur gleichen Uhrzeit, sind die Transportbedingungen konstant geblieben? Eine evtl. veränderte Matrix kann nicht nur zu zusätzlichen Peaks führen, sondern durch eine Änderung des pH-Wertes auch zu Retentionszeitverschiebungen, Änderung der Peakform, im schlimmsten Fall auch zu einer Veränderung der Peakfläche. Beispiel: Eine hochdosierte Tablette hat eine andere Konzentration an Magnesiumkarbonat als die zuletzt gemessenen Proben, was zu einer Veränderung des pH-Wertes der Wirkstofflösung führt; die nun ionisiert vorliegende Form des Wirkstoffs hat eine andere UV-Absorption. Der pH-Wert der Standard-/Systemeignungslösung bleibt dagegen konstant
  1. Veränderungen, die von „außen“ kommen
  • Das Material der neu eingebauten Injektionsnadel ist ein wenig oder gänzlich „anders“; evtl. werden jetzt mehr/andere Metallionen herausgewaschen, die mit Bestandteilen der Probe beispielsweise Komplexe bilden. Bemerkung am Rande: Nicht nur Eisen- sondern auch Titanionen sind zur Komplexierung fähig …
  • Die Proben waren womöglich längere Zeit als sonst dem Sonnenlicht ausgesetzt oder es wird neulich in unmittelbarer Nähe des Autosamplers mit starkflüchtigen Aromastoffen gearbeitet
  • Bei der Person, die die vials vorbereitet, gab es eine – wie auch immer geartete – Veränderung, die direkt oder indirekt mit dem Handling zu tun hat, z. B: Neues Parfum oder die Hände werden nun eingecremt oder es erfolgt seit einigen Wochen eine Hormontherapie (Diffusion von Aminosäuren aus der Haut). Oder aber man hat Ihnen gesagt, dass das Schütteln eines vials generell von Vorteil sei, und Sie nahmen diese Empfehlung seit kurzem an
  • Neue/andere Septen bzgl. Farbe, Material, Aufbau – ihr Einfluss sollte ernst genommen werden!
  • Die Proben werden vielleicht im Ultraschallbad aufgelöst. Und dort gab es eine Veränderung, die wahrlich viel bedeuten kann: Neues U-Bad, z. B. rund statt eckig, statt 30 kHz jetzt 50 kHz, statt Leitungswasser jetzt destilliertes Wasser, die Wasserhöhe ist eine andere, es ist eine Gummimatte unter das U-Bad gelegt worden, die Probelösungen befinden sich jetzt in einem (größeren) Becherglas statt in einem Drahtgestell, oder aber: Es wird zwar weiterhin ein Drahtgestell verwendet, jedoch mit größeren Maschen, usw.

Das Fazit

Neue Charge von vials/Septen, kleinere Veränderungen im Handling, geänderte Matrix oder Änderungen am Probengeber bzw. an der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Anlage sind mögliche Ursachen für Veränderungen des Inhalts des vials und folglich für veränderte Chromatogramme bei sonst gleichen chromatographischen Bedingungen.

 

 

Die Kleinen im Sommer: Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit

Von Allgemein, Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung des Chromatogramms

Geisterpeaks – aber erst „später“ Verbesserung der Empfindlichkeit Geisterpeaks, die „später“ oder erst in einigen Tagen erscheinen Geisterpeaks erscheinen meist plötzlich. Man wundert sich wieso, hat man doch an den chromatographischen Bedingungen nichts geändert. Nun, es sind schon einige Situationen denkbar, in denen Geisterpeaks erst nach einer gewissen Zeit zu sehen sind. Nachfolgend einige Beispiele dazu (zur Problematik von Geisterpeaks ab und an siehe auch diesen Tipp):           Katalytische Wirkung des Kieselgels Kieselgel ist ein guter Feststoffkatalysator; bei längeren Läufen werden womöglich nur solche Substanzen verändert, die lange an der Oberfläche des Materials haften und somit…

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Ultraschallbad und Peakfläche

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Wasser

Der Fall Das Ultraschallbad wird häufig auch zum Auflösen von Proben verwendet. Sein Einfluss auf die späteren chromatographischen Ergebnisse sollte nicht unterschätzt werden. Im Falle von schwankenden Peakflächen sollte ggf. an mögliche Variabilitäten im Zusammenhang mit dem Ultraschallbad gedacht werden. Die Lösung Es existieren verschiedene Einflussfaktoren, von denen hier einige aufgeführt sind:           Verteilung der Energie/Temperatur Welches Wasser wird verwendet, Leitungs- oder destilliertes Wasser? Wie ist der Wasserstand? Bei hohem Wasserstand: Geringe Energie, dafür jedoch homogen verteilt. Niedriger Wasserstand: Erhöhte Energie, dadurch effektiveres Auflösevermögen. Durch die höhere Temperatur besteht allerdings eine größere Gefahr von Hydrolyse, Umlagerung…

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HPLC im Frühjahr… 

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Auto-Sampler, Detektor, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche…

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Die Kleinen im Sommer – Ursachen für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Der Fall Geisterpeaks sind immer wieder ein Problem – leider. Obschon häufig behandelt, möchte ich erneut das Thema aufgreifen und weiter unten ein paar eher seltenere Ursachen für plötzlich auftauchende Peaks schildern. Welche wären das? Die Lösung Vorbemerkung: Bei auftretenden Problemen frage ich die KollegInnen generell als erstes: „Habt ihr irgendetwas geändert, gab es etwaige räumliche Änderungen/Ereignisse, die mit dem Auftauchen des Problems zeitlich zusammen fallen“? Und dann kommt als Antwort, oft viel zu schnell: „Nein“. Bevor dieses „nein“ kommt, überlegen Sie sich bitte, ob vielleicht doch HPLC-relevante Sachen geändert wurden bzw. etwas „aus-der-Reihe“ passiert ist oder einfach anders läuft….

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Geisterpeaks durch Rückstände in der Mischkammer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Von Werner Röpke, Braunschweig Der Fall In einer von mehreren Benutzern abwechselnd gefahrenen HPLC-Gradientenanlage treten immer wieder unerklärliche Störungen im Chromatogramm auf, die auch durch intensives Spülen nicht zu beseitigen sind. Die Störungen halten sich hartnäckig, auch bei mehrfachem Durchlauf von Leergradienten ohne Säule. Probleme mit dem Injektionsventil können insoweit ausgeschlossen werden, als dass das Ventil nicht betätigt wird und die Störungen trotzdem auftreten. Die Lösung Die wenigsten Laboratorien sind in der Lage, für eine bestimmte HPLC-Analytik eine einzige Anlage vorzuhalten. Ein Laufmittelwechsel, auch mit sorgfältigstem Spülen unter Verwendung intermediärer Phasen, hinterlässt immer Spuren. Isokratische HPLC-Systeme sind etwas unempfindlicher, denn…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Totvolumen, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

  Ein paar Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen Änderung der Peakform und der Peakfläche durch ungewollte Änderung des pH-Wertes Wiederfindung abhängig von der (Glas)Oberfläche In diesem Tipp haben wir bereits einige Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen besprochen,  auch hier wurde das Thema behandelt. Nun, weiter unten einige Weitere: Retentionszeit bei isokratischen Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Abnahme der Retentionszeit um Faktor 2 Retentionszeit bei Gradienten-Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Natürlich ebenso Abnahme der Retentionszeit, allerdings abhängig von mehreren Faktoren lediglich um ca. 10-30% Und überhaupt: Die Retentionszeit wird bei Gradientenläufen vom Start- und End % B sowie von…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Luft entfernen Bessere Wiederfindungsrate Stärkeres Rauschen oder Geisterpeaks immer um 17.00 Uhr oder nur „gestern“… 1. Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Bekanntlich sehen die Peaks beim Gradienten normalerweise schön aus: Schmal, symmetrisch, im Idealfall bleibt die Peakbreite bei allen Peaks konstant. Nehmen wir jetzt an, Sie fahren einen Gradienten im HILIC-Modus. An einigen Bereichen des Chromatogramms sehen die Peaks gut aus, an einigen Bereichen wiederum erhalten Sie breite Peaks. Mögliche Erklärung: je nach aktueller Eluentenzusammensetzung, die in diesem Moment die Säule erreicht, kann bei der Wechselwirkung der Substanz(en) mit den funktionellen…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Eluent, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Lösungsmittel, Uncategorized

Der Eluent ist eine schier unendliche Geschichte… 1. Von „Gebirgen“ in der Basislinie und Läufe im Sommer und im Winter imfalle von ACN/Wasser-Eluenten Der Fall Sagen wir, Ihnen ist aufgefallen, dass Sie im Sommer mit ACN/Wasser- bzw. Puffer-Gemischen mehr Probleme haben als im Winter: Basislinieschwankungen, evtl. zusätzliche, breite Peaks etc. Mögliche Erklärung: Eine frisch hergestellte Mischung beispielsweise von 85/15 ACN/Wasser- bzw. Puffer ist bekanntlich kalt und wir haben zunächst auch keine Probleme. Es kann nun passieren, dass im Sommer trotz Klima-Anlage die Temperatur im Labor 27-29 °C beträgt. Die höhere Temperatur begünstigt die Bildung von Polymeren – ein bekanntes Problem…

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