Der Fall Nehmen wir an, Ihre Peaks, die ab ca. der 3-fachen Totzeit eluieren (also ab einem Retentionsfaktor von k = 3, was genügend starke Wechselwirkungen bedeutet), werden ordentlich getrennt. Kopfzerbrechen bereiten Ihnen eher die polaren Komponenten, die direkt nach der Totzeit eluieren – ihre Trennung sei dürftig. Verständlicherweise möchten Sie ungerne gleich die gesamte Methode verändern. Was wäre nun zu tun? Die Lösung Für die Verbesserung der Trennung von polaren Komponenten in der RP-HPLC könnte man sich einen 3-Stufen-Plan mit zunehmendem Aufwand vorstellen: Einfache Maßnahmen – Manipulation (im positiven Sinne!) der Probelösung – Probelösung polarer machen, um eine „On…
Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze…
Der Fall Negative Peaks stellen eine ärgerliche Sache dar, die bei einigen Applikationen stets zu beklagen ist oder aber sie tauchen immer wieder völlig unberechenbar auf. Was könnte(n) die Ursache(n) sein? Die Lösung Wie leider Gottes in der HPLC üblich, gibt es eine ganze Reihe von möglichen Ursachen. Nachfolgend werden die häufigsten genannt. Brechungsindex- bzw. Leitfähigkeitsdifferenz Die meisten UV-Detektoren sind nicht Brechungsindex-entkoppelt, d.h. sie registrieren eine eventuelle Differenz zwischen dem (konstanten) Brechungsindex des Eluenten und dem Brechungsindex des Eluentensegments, das gerade die Zelle passiert. Das kann eine Luftblase sein, oder irgend welche Schlieren durch eine Druckwelle, die durch das Gerät…
Der Fall Wir wissen alle, was die Totzeit, t0 , (Front, Frontpeak, Durchbruchzeit, Mobilzeit, Lösungsmittelpeak, „Luftpeak“) bedeutet: Das ist die Aufenthaltszeit einer Substanz im Eluenten. Also die Zeit, die eine Substanz benötigt, um vom Injektionspunkt bis zum Detektor zu gelangen – falls die Substanz nicht an der stationären Phase „hängen“ bleibt: Eine solche Komponente verhält sich im gegebenen chromatographischen System inert. Das ist logischerweise gleichzeitig die Elutionszeit für ein Eluentenmolekül. Konsequenterweise dürfte keine Substanz vor t0 eluieren, sie kann ja nicht schneller sein, als z. B. ein Methanolmolekül – oder doch? Die Lösung Ja, Peaks vor der Front sind in der…
Der Fall Fast in jedem HPLC-Buch wird auf diese Begriffe aus der Theorie der HPLC eingegangen. Fühlt sich jeder Autor irgendwo der HPLC-Theorie verpflichtet oder kann man als „normaler“ Mensch mit diesen Dingen tatsächlich etwas anfangen? Die Lösung Ja, ich denke entschieden ja! Die Reihenfolge einer vernünftigen Vorgehensweise bei der Optimierung in der Sorptions-HPLC lautet prinzipiell: 1) Optimalen k-Bereich einstellen („vernünftige“ Wechselwirkungen/Retention überhaupt) 2) Selektivität verbessern (unterschiedlich stark Wechselwirkungen der zu trennenden Komponenten) 3) Effizienz erhöhen („gute“ Peakform) Aus einem Chromatogramm erkennt man oft, in welchem Stadium der Optimierung man sich befindet. Siehe dazu nachfolgende Tabelle. Der Einfachheit halber gehen…
Der Fall Angenommen, Ihre Peaks kommen in einem C18-ACN/H2O- oder MeOH/H2O-System viel zu früh, sagen wir irgendwo zwischen Totzeit und zweifacher Totzeit. Wenn Sie die Säule nicht überladen haben, dann liegt der Grund wohl darin, dass Ihre Substanzen sehr polar oder sogar ionisch sind. Wie können Sie nun die Retentionszeit erhöhen? Die Lösung Nachfolgend einige Möglichkeiten: Erster Fall: k-Werte (Retentionsfaktoren, relative Retention) sollen konstant bleiben; ,,Chemie“ bleibt konstant, d. h. die Wechselwirkungen mit der stationären Phase ändern sich nicht. Maßnahme: Säulenlänge erhöhen, Fluss erniedrigen Zweiter Fall: Änderung der k-Werte, d. h. es erfolgt ein Eingriff in die Wechselwirkung Substanz-stationäre Phase:…