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pH-Wert des Eluenten

Eine passende Frage zu diesem Befund …

Von A Fehlersuche, Allgemein, B Optimierung, Eluent, Jahrestipps, Monatstipp, Optimierung, pH-Wert des Eluenten

Liebe Leserinnen, liebe Leser,

weiter unten finden Sie den jeweils ersten Teil der halben Sätze aus dem Dezember-Tipp, so dass nun die Befunde komplett sind:

Ich weiß, dass …

sich der Fluss geändert hat (Leck, Luft in der Pumpe)… weil die Peakfläche, aber kaum die Peakhöhe sich geändert hat

das Probelösungsmittel organischer ist als der Eluent/der Anfangsgradient… weil die frühen Peaks mit einem starken Fronting eluieren

der pH-Wert des Eluenten sich geändert hat oder – seltener – funktionelle Gruppen auf der stationären Phase hydrolysiert worden und dadurch nun mehr Silanolgruppen vorhanden sind … weil nur einige Peaks tailen und auch später eluieren – restliche Peaks sind OK

dass ich eine recht hydrophobe, endcappte, „klassische“ C18 stationäre Phase habe… weil eine derartige RP-Phase sehr ähnliche Komponenten (z. B. Isomere) nicht trennen kann

dass ich in der Probe entweder sehr große Moleküle oder sehr kleine, ionisch vorliegende Substanzen habe… weil solche Komponenten vor der Totzeit eluieren (Peaks vom letzten Lauf, Kontaminationen im Eluenten, Luft usw. können ausgeschlossen werden)

dass das Totvolumen der Apparatur zu groß im Vergleich zu dem Säulenvolumen ist…weil dies die einzige Ursache sein kann, dass bei neutralen Komponenten die Peaksymmetrie mit zunehmender Retention besser wird

— wenn es um das Erfassen aller Komponenten in der Probe geht, zusätzlich ein Universaldetektor wie z. B. CAD (Charge Aerosol Detector) benötigt wird… weil nicht alle Substanzen UV-aktiv sind bzw. ionisiert werden können

ich Methanol als organisches Lösungsmittel und niedrige Temperatur brauche …weil bei diesen Bedingungen polare Komponenten in der Regel besser zu trennen sind

meine Moleküle mit ausgewaschenen Metallionen aus allerlei Metalloberflächen Komplexe bilden bzw. dort teilweise adsorbiert werden… weil bei Verwendung von PEEK-Kapillaren, einer PEEK-lined Säule sowie einer Injektionsnadel aus PEEK oder Keramik die Peaksymmetrie wesentlich besser wurde

ich meine wässrige Probelösung mit 5-10% ACN oder Iso-OH versetzen sollte …weil durch diesen Zusatz in der wässrigen Probelösung die Adsorption der Analyte an allerlei Metalloberflächen in der HPLC-Apparatur (Physisorption, Adhäsion) verhindert bzw. minimiert wird

 

Woher kommt das – weitere Symptome

Von A Fehlersuche, Allgemein, Fluss, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Totvolumen

Liebe Leser:innen, zunächst wünsche ich Ihnen ein gesundes, zufriedenes und erfolgreiches Jahr 2023. Im letzten HPLC-Tipp des Jahres 2022 hatte ich Ihnen die Kurztabelle „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. In der zusätzlichen Spalte nun „Welches Symptom noch?“ finden Sie weitere Informationen, die man/frau dem Chromatogramm bzw. den Anzeigen am Gerät entnehmen kann. Diese helfen, die jeweilige Ursache(n) noch genauer zu spezifizieren bzw. noch mehr einzugrenzen.   Änderung (Symptom) Ursache(n) Welches Symptom noch? Kommentar ∆ A + ∆ H 1. ∆ Injektionsvolumen 2. Irreversible Adsorption (Physisorption, Memory-Effekt) 3. ∆ Detektor 4. Instabile Probe 5. ∆ pH-Wert 6. ∆ Probekonzentration                 5. ∆ Peakform 1. Neben Luft und verstopfte Nadel durch “Krümmelchen”, auch unpassende Ansaug- und/oder Injektionsgeschwindigkeit 2. … z. B. an einer Stahloberfläche (Stahlkapillare. Metallsiebchen) 3. Schwache Lampe, Belag in der Zelle 5. Eine ungewollte Änderung des pH-Wertes kann die UV-Absorption beeinflussen 6. Organisches Lösemittel kann bei ungekühltem Autosampler aus dem vial entweichen (anreichern der Probe) ∆ H + ∆ tR, A = konstant 1. Eluent 2. ∆ stationäre Phase 3. ∆ Temperatur 1. ∆ P     3. ∆ P Stets: t0 = konstant, bei isokratischen Trennungen in der Regel auch ∆ Peakform…

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Woher kommt das?

Von A Fehlersuche, Bodenzahl, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Pumpe, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Typischen Symptomen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden; oder aber die Zahl der infrage kommenden Ursachen kann durch Beurteilung der Symptome („Welche Veränderung kann dieses Symptom bedingen und welche definitiv nicht?“) wenigstens eingegrenzt werden. Nachfolgend werden beispielhaft sieben häufige „Symptome-Ursachen“ in der Routine-HPLC vorgestellt. Bei Bedarf erfolgt auch ein Kommentar. Für die vorgestellten Fälle gelten folgende Annahmen: Keine bewusste Änderung seitens der Anwender:innen, z. B. es wurde keine längere Säule eingebaut Es handelt sich vorwiegend um RP-Trennungen mit einem konzentrationsempfindlichen Detektor wie beispielsweise UVVis, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor Weiter unten sind die häufigsten Ursachen genannt Symbole: ∆: Änderung H: Peakhöhe A:…

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Gründe für eine Verschiebung des pH-Wertes

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten

Der Fall Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert…

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Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen/erniedrigen?  

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säule, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über folgenden Tatbestand unterhalten: Wenn ich in der HPLC einen physikalischen Parameter verändere, ist das Ergebnis selten eindeutig „gut“ oder „schlecht“. Je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen überwiegen Vor- oder eben Nachteile. Dies gilt analog auch für chemische Parameter. Hier wollen wir stellvertretend sechs solcher betrachten, siehe Tabelle 1. Die Lösung   Was Nachteile Vorteile Erhöhung der Temperatur In der Regel Abnahme der Selektivität und der Lebensdauer der Säule, ferner erhöhte Gefahr für  Zersetzung von thermolabiler Analyten Abnahme der Retentionszeit und des Druckes, Verbesserung der Peakform und dadurch Zunahme der Peakkapazität (Anzahl der…

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Zusätze in der Probelösung  

Von Auflösung, B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized

Der Fall Additiva (Modifier) oder einfache Zusätze wie Salze in der mobilen Phase können die Trennung positiv beeinflussen, ihr Einsatz bewährt sich seit Jahrzehnten. So kann beispielsweise die Peaksymmetrie und dadurch indirekt die Empfindlichkeit durch Verwendung von etwa Di- oder Triethylamin, DEA/TEA, Di-Tri- oder Fluoressigsäure, DFA/TFA/FA, Ionenpaarreagenzien wie Heptan- oder Oktansulfonsäure erhöht werden. Das Problem dabei: Solche Additiva werden teilweise an der Oberfläche der stationären Phase (irreversibel) adsorbiert, was in der Routine vielleicht ein geringe(re)s Problem darstellt. In der Methodenentwicklung jedoch ist dies störend, weil ja nach jedem Experiment die Säule mühsam durch Spülen wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized, Verweilvolumen

„Dreck“ bzw. Matrix mal anders… „Dreck“ in einer HPLC-Anlage ist unangenehm, jener kann unterschiedlichen Ursprungs sein: Matrixbestandteile, Verunreinigungen aus der Probelösung oder dem Eluenten, Polymere aus dem Acetonitril, Kontaminationen aus dem Gerät etc. Eluiert der „Dreck“ einmalig oder unregelmäßig mit der mobilen Phase, lauten die üblichen Probleme: Geisterpeak(s), „Buckel“, „Wellen“, „Gebirge“ in der Basislinie, verstärktes Rauschen. Haftet er jedoch irreversibel oder auch länger an diversen Oberflächen wie Fritten, Injektionsnadel, Septum, Verbindungsstücke, „column saver“ (on-line Filter vor der Vorsäule) etc., müssen wir in diesem Fall mit einer weiteren Konsequenz rechnen: Memoryeffekt bzw. Retentionszeitverschiebung. Nachfolgend zwei Beispiele zur Retentionszeitverschiebung: In PV´ s…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

  Ein paar Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen Änderung der Peakform und der Peakfläche durch ungewollte Änderung des pH-Wertes Wiederfindung abhängig von der (Glas)Oberfläche In diesem Tipp haben wir bereits einige Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen besprochen,  auch hier wurde das Thema behandelt. Nun, weiter unten einige Weitere: Retentionszeit bei isokratischen Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Abnahme der Retentionszeit um Faktor 2 Retentionszeit bei Gradienten-Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Natürlich ebenso Abnahme der Retentionszeit, allerdings abhängig von mehreren Faktoren lediglich um ca. 10-30% Und überhaupt: Die Retentionszeit wird bei Gradientenläufen vom Start- und End % B sowie von…

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RP-HPLC bei extremen pH-Werten

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Lösungsmittel, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Robustheit

Der Fall Nehmen wir an, die beste Selektivität erzielen Sie bei einem pH-Wert von ca. 1,5-2 bzw. 9-10. Ihre Säule ist in diesem Fall in der Regel nicht sonderlich begeistert: Im Sauren besteht die Gefahr der Abspaltung der funktionellen Gruppe(n) durch Hydrolyse („Bluten“ der Säule) – jene Gefahr ist um so größer je kürzer/polarer die funktionelle(n) Gruppe(n) ist/sind. Im Alkalischen kann das Kieselgel sich auflösen. Was tun nun, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig einige Empfehlungen für beide Fälle: 1. Arbeiten im Sauren Säule: Verwenden Sie möglichst Zorbax SB oder eine Hybrid-Säule (siehe weiter unten)…

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