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A Fehlersuche

Probleme erst gegen Ende der Sequenz – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Monatstipp, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall

Zu Beginn einer längeren Sequenz läuft alles bestens. Gegen Sequenz-Ende jedoch tauchen verstärkt Probleme auf, z. B. Geisterpeaks, Veränderung der Peakform und/oder der Peakfläche und nicht zuletzt Verschiebung der Retentionszeit. Welche Ursachen kommen in Frage?

Die Lösung

Es handelt sich hierbei wohl um Ursachen, die zeitabhängig sind.

Nachfolgend eine Auswahl von Symptomen und möglichen Ursachen:

Temperatur zum Ersten: Druck-, evtl. auch Peakfläche-Schwankungen

  • Es finden manchmal aufgrund einer niedrigen Temperatur im Probengeber Nachfällungen statt, die erst später einsetzen und zu folgenden Problemen führen können: Verstopfung der Injektionsnadel, Niederschlag am Siebchen direkt am Säulenkopf usw. Vorgehen, um ein kommendes Problem rechtzeitig zu erkennen, ob also Gefahr für Niederschlag besteht (Tipp von Jens Braun, BioChem): Probelösung einfach kalt machen und anschließend zentrifugieren

Temperatur zum Zweiten: Bessere Peakform, Zunahme der Peakfläche

  • Wenn die Standard-/SST-lösung organischer als der Eluent/Anfangsgradient ist, entsteht Fronting, mitunter bei sehr frühen Peaks auch „Buckel“. Wenn nun aus jener Lösung im Laufe der Sequenz häufig injiziert wird, kann das organische Lösungsmittel u.U. verdampfen, Ergebnis: Aufkonzentrierung der Probe im Vial, die Peakfläche nimmt zu und dadurch, dass nun die Probelösung womöglich „Eluent-ähnlicher“ geworden ist, ergibt sich eine Verbesserung der Peakform

Temperatur zum Dritten: Zunahme der Peakfläche und/oder größerer Variationskoeffizient

  • Eine häufige Praxis: Damit bei einer Verwendung von vorgeschlitzten Septen kein Lösungsmittel aus dem Vial entweichen kann, wird die Temperatur des Probengebers gesenkt. Die Peakflächen nehmen mit der Zeit evtl. zu, eine mögliche Ursache wäre: Die Ansaug- (aspiration time) – aber auch die Injektionsgeschwindigkeit! – wurde der sich geänderten Viskosität nicht angepasst. Injektionen von viskosen Probelösungen bei relativer großer Ansauggeschwindigkeit führen ferner zu großen Variationskoeffizienten (unreproduzierbare Peakflächen)

Geisterpeaks, die erst später erscheinen

  • In Tetrahydrofuran von HPLC-Qualität sind erwartungsgemäß keine Stabilisatoren enthalten. Wenn nun die THF-Flasche etwas älter und auch keine Stickstoff-Atmosphäre vorhanden ist und die Flasche weder mit Alufolie umwickelt ist noch im dunklen Schrank/Kühlschrank aufbewahrt wird, können Peroxide entstehen. Diese sammeln sich am Säulenkopf und eluieren erst später gegen Ende eines Gradientenlaufs

Verschiebung der Retentionszeit verbunden mit Veränderung, meist Verschlechterung, der Peakform  

  • Durch eine etwas „schiefe“ Bewegung des Kolbens in der Pumpe kann Eluent in die Flüssigkeit der Hinterkolbenspülung gelangen. Überprüfung: Die Flüssigkeit vermehrt sich auf wundersamen Weisen, auch ein einfacher sensorischer Test offenbart das Problem. Durch eine derartige, zwar geringe jedoch stete Veränderung der Eluentenzusammensetzung ergibt sich eine schleichende Retentionszeitverschiebung
  • Bei bestimmten nicht-silanisierten Vials kann der pH-Wert einer wässrigen Probelösung innerhalb einer Stunde u.U. sich um mehr als eine pH-Einheit ändern
  • Bestandteile der Probe verändern im Laufe der Zeit das Füllmaterial der Säule, die Wechselwirkungen ändern sich ebenso, z. B. Schwermetallionen belegen die Kieselgelmatrix, Matrixbestandteile wie Stärke, Fette, Dextrane, Fette, Propylenglykol usw. die Oberfläche der stationären Phase – die Probleme erscheinen erst mit der Zeit …

Das Fazit

Vor der Adaption einer Methode in der Routine ist es im Falle von vorgesehenen langen Sequenzen ratsam, die Stabilität chromatographischer Größen wie Retentionszeit und Peakfläche über die Zeit gezielt zu testen. Oft werden bei der Methodenentwicklung keine langen Sequenzen verwendet, mögliche Probleme bleiben somit am Anfang im Verborgenen.

Gründe für eine Verschiebung des pH-Wertes

Von A Fehlersuche, Jahrestipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten

Der Fall Eine unbeabsichtigte Verschiebung des pH-Wertes kann bei polaren Komponenten viel bewirken. Und das Risiko einer Verschiebung besteht dann, wenn der Mess-pH-Wert nahe dem pKS– bzw. pKB-Wert der betreffenden sauren bzw. basischen Komponente befindet. Es gibt kaum eine chromatographisch relevante Größe, die sich dabei nicht ändern kann: Retentionszeit, Peakform, Peakfläche, Nachweisgrenze, usw. Wir haben uns an dieser Stelle oft über die ein oder andere mögliche Ursache für eine Verschiebung des pH-Wertes unterhalten. Welche sind nun die wichtigsten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig die häufigsten Ursachen nach abnehmender Häufigkeit bzw. Relevanz Nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert des Eluenten, er driftet ins Alkalische, z. B: pH-Wert eines wässrigen Phosphatpuffers, 2,2, nach der Zugabe von 70 % Methanol ergibt sich ein „pH-Wert“ von ca. 4,0, nach der Zugabe von 70 % Acetonitril von ca. 3,0 Es wird der falsche Puffer verwendet, also ein Puffer, der im betreffenden pH-Wert-Bereich keine Pufferwirkung aufweist, z. B. Acetatpuffer bei einem eingestellten pH-Wert von 3,0 Es wird lediglich ein Salz und kein Puffer verwendet; oder aber man/frau spricht von „Puffer“, aber es wird lediglich angesäuert (z. B. 0,1 % TFA, Trifluoressigsäure) Der verwendete Puffer ist recht schwach; so hat man/frau nicht die Gewähr,…

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Zwei kleine Sommer-Tipps

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, Bodenzahl, Injektionsvolumen, Jahrestipps, kleine Peaks, Probengeber

Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen „Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse Temperatur   Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen? Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei 10 °C Abb. 1 Unterschiedliche  Beeinflussung von Selektivität und Retentionszeit bei einer Änderung der Temperatur, Details, siehe Text Die Trennleistung (= Effizienz), also letzten Endes die Peakform, kann sich bei einer Temperaturerhöhung um ca. 4 °C, T1 auf T2, nur minimal (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Val-Phase“, Abbildung 2) oder auch merklich verbessern (Abnahme der Bodenhöhe an Säule „L-Pro-Phase“, Abbildung 2). Das Ausmaß ist demnach abhängig – auch von der Säule   Abb. 2 Abhängig von der Säule, merkliche oder geringe Verbesserung der Peakform bei einer Temperaturerhöhung, Details, siehe Text Selbes Gerät, unterschiedliche Ergebnisse An einem qualifizierten und technisch einwandfreien…

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Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, Jahrestipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz (∆ Peakfläche, ∆ Peakform) Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform) Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare…

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Unruhige Basislinie – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Allgemein, Apparatur, Detektor, Dichtungen

Der Fall Starkes Rauschen der Basislinie hat hauptsächlich zwei Ursachen: Entweder sind es Flussschwankungen oder es handelt sich um elektronisches bzw. optisches Rauschen. Wie kann man die zwei Ursachen unterscheiden? Die Lösung In Abbildung 1 und 2 sind typische Beispiele von diversen „unschönen“ Basislinien. Es handelt sich dabei um eigene Messungen und um Beispiele von Günther Eppert, die mit Genehmigung gezeigt werden. Faustregel: Periodisches, mehr oder weniger regelmäßiges Rauschen deutet auf Probleme mit der Pumpe hin, das wäre „Mechanik“. Hochfrequentes, „unruhiges“ Rauschen deutet auf Elektronik bzw. Optik hin. Abbildung 1 Pumpe Abb. 1 Oberes und mittleres Bild: Flussschwankungen aufgrund von Luft in der Pumpe Unteres Bild: Defekte Kolbendichtung Abbildung 2 Detektor Abb. 2 Oberes Bild: Minimale Druckschwankungen im Bereich von ca. 0,1 bar wie hier führen zur Bildung von Schlieren, die vom UV-Detektor registriert werden und zu einem hochfrequenten Rauschen führen Mittleres Bild: Belag auf dem Fenster eines UV-Detektors Unteres Bild: Defekte Deuteriumlampe Das Fazit Beim periodischen, gleichmäßigen Rauschen ungefähr gleichbleibender Amplitude denke an die Pumpe: Dichtung, Leck, Luft. Beim hochfrequenten, unruhigen Rauschen denke an Elektronik bzw. Optik: Schwache Lampe, Haarriss am Detektor, Belag in der Zelle, verschmutztes MS-Interface, Spülautomat (oder sonstiges …) in unmittelbarer Nähe zu einer HPLC-Anlage mit…

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Vials als Quelle für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Probengeber

Vials – Glas-/Polymerkörper, Septen, Kappen – können eine Quelle für Geisterpeaks sein; nachfolgend skizziere ich einige Ursachen sowie mögliche Tests zum Erfassen und ggf. Lokalisierung des Problems. Mehrfache Injektion aus einem vial; erste Injektion OK, zweite und dritte, Geisterpeaks, vierte OK. Man kann schier verzweifeln…Eine mögliche Erklärung: Bei der ersten Injektion durchsticht die Nadel das erste Mal das frische Septum, es wird injiziert, alles bestens. Nach der Injektion erfolgt üblicherweise ein Purgen der Nadel. Bei der anschließenden zweiten Injektion befindet sich durch das Purgen womöglich Restlösungsmittel an der Außen-Oberfläche der Nadel. Jenes Lösungsmittel kann nun an der jetzt frei gewordenen Septum-Oberfläche an der Stichstelle Hilfsstoffe aus dem Septum herauslösen, die als kleine Zusatzpeaks erscheinen. Dies passiert vielleicht nur 1-2 Mal, denn: Die Konzentration dieser Hilfsstoffe ist gering, nach der vierten oder fünften Injektion sind sie „weg“, ab jetzt sind keine Geisterpeaks mehr zu sehen Die Probe befindet sich im Kühlschrank. Um einen Temperatur- und somit einen Konzentrationsgradienten im vial zu verhindern wird jenes gründlich durchgeschüttelt. Je nach Lösungsmittel in der Probelösung können Hilfsstoffe aus der Unterfläche des Septums herausgelöst werden – es erscheinen Geisterpeaks Teflon auf Gummi bei neuen Septen: Geisterpeaks Folgendes Problem dürfte nur bei älteren Materialien auftauchen, dennoch…

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Die Kleinen im Sommer: Permanent auftretender Geisterpeak, Faustregeln zu Log P und Log D, Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache

Von A Fehlersuche, Auflösung, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Systemeignungstest (SST), Uncategorized

  Permanent auftretender Geisterpeak Faustregeln zu Log P und Log D Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache Seit kurzem erscheint ein Geisterpeak bzw. stets ein Blindwert im Blank… Seit einiger Zeit taugt bei einer Methode – oder bei mehreren – die noch vor kurzem keine Probleme machte(n), ein Geisterpeak auf. Oder aber, Sie haben in Ihrem Blank auf einmal stets einen Blindwert. Und dieses Problem haben Sie unabhängig von der Anlage, dem/der Anwender(in) und sogar der Methode. D.h. das übliche Fehler-Ausschluss-Programm haben Sie gründlich aber leider erfolglos absolviert. Versuchen Sie in einem solchen Fall im Team sich zu erinnern,…

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Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen?  

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, HPLC-Tipps Demo, Säule, Verweilvolumen
Der Fall Selten sind Eigenschaften eindeutig nur als positiv oder als negativ zu bezeichnen. So hat ein Ferrari zwar Vorteile. Wenn ich allerdings mit diesem Vehikel und mit meinen vier Kindern und mit meiner Schwiegermutter und mit unserem Hund Mitte August nach Griechenland fahren will, wird es gelinde gesagt mindestens „interessant“…Genauso verhält es sich mit Änderungen. Sie bescheren selten nur „gute“ oder nur „schlechte“ Ergebnisse, so auch in der HPLC: Wenn ich einen Parameter verändere, ergeben sich je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen Vor- oder eben Nachteile. In Tabelle 1 finden Sie sechs physikalische Parameter mit einer differenzierten Betrachtung deren Auswirkungen....
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Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)…

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HPLC im Frühjahr… 

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Auto-Sampler, Detektor, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche…

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