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A Fehlersuche

Geisterpeaks durch Rückstände in der Mischkammer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Von Werner Röpke, Braunschweig Der Fall In einer von mehreren Benutzern abwechselnd gefahrenen HPLC-Gradientenanlage treten immer wieder unerklärliche Störungen im Chromatogramm auf, die auch durch intensives Spülen nicht zu beseitigen sind. Die Störungen halten sich hartnäckig, auch bei mehrfachem Durchlauf von Leergradienten ohne Säule. Probleme mit dem Injektionsventil können insoweit ausgeschlossen werden, als dass das Ventil nicht betätigt wird und die Störungen trotzdem auftreten. Die Lösung Die wenigsten Laboratorien sind in der Lage, für eine bestimmte HPLC-Analytik eine einzige Anlage vorzuhalten. Ein Laufmittelwechsel, auch mit sorgfältigstem Spülen unter Verwendung intermediärer Phasen, hinterlässt immer Spuren. Isokratische HPLC-Systeme sind etwas unempfindlicher, denn…

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Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden III

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Verweilvolumen

Im zweiten Teil der kleinen Tipps-Serie zum Methodentransfer von HPLC-Methoden hat Mike Hillebrand auf fehlende Infos beim Methodentransfer hingewiesen. Fehlende Infos dürften in der Tat eine der häufigsten Ursachen für missglückte Methodentransfers sein. Im dritten und letzten Tipp zu diesem Thema greife ich daher diese Problematik erneut auf, dabei beschränke ich mich auf zwei Felder Themen: Beispielhaft werden weiter relevante Informationen bzgl. Hardware sowie „Probe auflösen“ genannt, die leider nicht immer weitergegeben werden. Diese Liste ist natürlich beliebig erweiterbar. Wichtige Infos, die die HPLC-Anlage betreffen – gleiche Anlage, anderes Ergebnis Man verwendet eine baugleiche Gradientenanlage und geht folglich davon aus, dass…

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Ein paar Infos zum Inneren eines UV-Detektors

Von A Fehlersuche, Apparatur, Detektor, HPLC-Tipps

Der Fall Wir erleben seit längerem einen unaufhaltsamen Siegeszug der HPLC/MS-Kopplung. In Forschungsbereichen ist sie nicht mehr wegzudenken, die Vorteile liegen auf der Hand. In der Routine ist andererseits der UV-Detektor nach wie vor die Nummer 1 unter den Detektoren – obschon die LC/MS-Kopplung rasch aufholt. Wir wollen heute einen Blick in den UV-Detektor hinein werfen: An was sollte man beim Auftreten von Problemen denken? Die Lösung Die nachfolgenden Infos und Tipps richten sich vor allem an KollegInnen, die „Hand“ an das Gerät legen möchten/dürfen. Die erste Maßnahme: Im Falle von Drift und/oder Buckel in der Basislinie kann als erstes die…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Probengeber, Uncategorized, Verweilvolumen

Übernahme einer Methode in die Routine, Formulierungen in Prüfvorschriften… Eine Gradienten-Methode wurde mit einer Pumpe entwickelt, die keinen Pulsationsdämpfer enthielt. Das merkliche aber doch eher geringe Rauschen der Basislinie hat den Methodenentwickler nicht weiter gestört. Der Routineanwender hat für sein baugleiches Gerät (Niederdruckgradient) einen Pulsationsdämpfer bestellt und einbauen lassen, weil er bei den zu erwartenden kleinen Peaks größere Probleme in der täglichen Integration verhindern wollte. Das Rauschen war tatsächlich signifikant kleiner geworden. Aber: Die Retentionszeit hat sich verschoben, das Chromatogramm sah anders aus. Erklärung: Durch den Pulsationsdämpfer hat sich das Verweilvolumen (Dwell volume) der Apparatur geändert und dies kann leider…

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Die „Kleinen“ im Sommer …

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Peakverbreiterung, Uncategorized

Ein paar DAD- und MS-relevanten Themen… Zunächst erfolgen ein paar Hinweise zur LC/MS-Kopplung: Bekanntlich ist TFA (Trifluoressigsäure) ein häufiges, gern verwendetes Additiv – nicht nur in der LC/MS-Kopplung. Folgender Fall: Eluent A: 0,1 % TFA, Eluent B: 0,085% in ACN, beide Lösungen ein Monat alt, Behältnis aus Weißglas. Die Injektion einer verdünnten Probelösung (pH-Wert = 7) führt zu einem fürchterlichen „Buckel“. Wird die Konzentration von TFA im Eluenten B ebenfalls auf 0,1 % erhöht, verschwindet der Buckel. Wird die Probelösung mit Acetatpuffer versetzt ist der Buckel ebenfalls verschwunden – auch im Falle des 0,085%igen Eluenten. Ebenso bei Erhöhung der Konzentration…

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Modernes HPLC/UHPLC gekauft, dennoch unzufrieden – warum? I

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Sie haben ein modernes HPLC- oder gar ein recht teures UHPLC-Gerät gekauft. Voller Freude sind Sie auf die ersten tollen Ergebnissen gespannt. Dann die große Enttäuschung: Ihre Peaks zeigen ein Fronting, die Auflösung ist schlechter als an Ihrer alten „Kiste“ und/oder die Peaks sind wesentlich kleiner als sonst. Dass das Gerät qualifiziert wurde und demnach keine technischen Probleme vorliegen, ist völlig klar. Was ist los? Die Lösung Lasst uns jedes Problem, das ich weiter oben genannt habe, separat behandeln. Betrachten wir hier das Fronting und in diesem HPLC-Tipp widmen wir uns dann der schlechteren Auflösung und dem Empfindlichkeitsverlust….

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Uncategorized

Peakfläche und Injektion, Spülen von RP-Säulen Mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche (hier: Injektor) Weitgehend bekannte Ursachen wie Leckage, Luft in der Spritze, verstopftes Nadelloch durch Dichtungsmaterial/Septumpartikelchen/Salz etc. lassen wir heute außer Acht, ich würde gerne eher auf Sachen eingehen, an die man vielleicht nicht sofort denkt. Nachfolgend stichwortartig einige Ideen und Denkanstöße. Erstes großes Thema: Memory-Effekt durch Physisorption bestimmter Analyte an unterschiedlichen Oberflächen. Merke: Die Affinität gegenüber Oberflächen hängt nicht nur vom Material der Oberfläche selbst, sondern auch von den chromatographischen Bedingungen ab. Unterschiedliches Material der Kapillare (Peek vs. Stahl) Unterschiedliches Material der Nadel (Stahl vs. Messing vs. Titan vs. Peek vs. Keramik) auch…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized, Verweilvolumen

„Dreck“ bzw. Matrix mal anders… „Dreck“ in einer HPLC-Anlage ist unangenehm, jener kann unterschiedlichen Ursprungs sein: Matrixbestandteile, Verunreinigungen aus der Probelösung oder dem Eluenten, Polymere aus dem Acetonitril, Kontaminationen aus dem Gerät etc. Eluiert der „Dreck“ einmalig oder unregelmäßig mit der mobilen Phase, lauten die üblichen Probleme: Geisterpeak(s), „Buckel“, „Wellen“, „Gebirge“ in der Basislinie, verstärktes Rauschen. Haftet er jedoch irreversibel oder auch länger an diversen Oberflächen wie Fritten, Injektionsnadel, Septum, Verbindungsstücke, „column saver“ (on-line Filter vor der Vorsäule) etc., müssen wir in diesem Fall mit einer weiteren Konsequenz rechnen: Memoryeffekt bzw. Retentionszeitverschiebung. Nachfolgend zwei Beispiele zur Retentionszeitverschiebung: In PV´ s…

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