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A Fehlersuche

Die „Kleinen“ im Sommer …

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Peakverbreiterung, Uncategorized

Ein paar DAD- und MS-relevanten Themen… Zunächst erfolgen ein paar Hinweise zur LC/MS-Kopplung: Bekanntlich ist TFA (Trifluoressigsäure) ein häufiges, gern verwendetes Additiv – nicht nur in der LC/MS-Kopplung. Folgender Fall: Eluent A: 0,1 % TFA, Eluent B: 0,085% in ACN, beide Lösungen ein Monat alt, Behältnis aus Weißglas. Die Injektion einer verdünnten Probelösung (pH-Wert = 7) führt zu einem fürchterlichen „Buckel“. Wird die Konzentration von TFA im Eluenten B ebenfalls auf 0,1 % erhöht, verschwindet der Buckel. Wird die Probelösung mit Acetatpuffer versetzt ist der Buckel ebenfalls verschwunden – auch im Falle des 0,085%igen Eluenten. Ebenso bei Erhöhung der Konzentration…

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Modernes HPLC/UHPLC gekauft, dennoch unzufrieden – warum? I

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Sie haben ein modernes HPLC- oder gar ein recht teures UHPLC-Gerät gekauft. Voller Freude sind Sie auf die ersten tollen Ergebnissen gespannt. Dann die große Enttäuschung: Ihre Peaks zeigen ein Fronting, die Auflösung ist schlechter als an Ihrer alten „Kiste“ und/oder die Peaks sind wesentlich kleiner als sonst. Dass das Gerät qualifiziert wurde und demnach keine technischen Probleme vorliegen, ist völlig klar. Was ist los? Die Lösung Lasst uns jedes Problem, das ich weiter oben genannt habe, separat behandeln. Betrachten wir hier das Fronting und in diesem HPLC-Tipp widmen wir uns dann der schlechteren Auflösung und dem Empfindlichkeitsverlust….

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Uncategorized

Peakfläche und Injektion, Spülen von RP-Säulen Mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche (hier: Injektor) Weitgehend bekannte Ursachen wie Leckage, Luft in der Spritze, verstopftes Nadelloch durch Dichtungsmaterial/Septumpartikelchen/Salz etc. lassen wir heute außer Acht, ich würde gerne eher auf Sachen eingehen, an die man vielleicht nicht sofort denkt. Nachfolgend stichwortartig einige Ideen und Denkanstöße. Erstes großes Thema: Memory-Effekt durch Physisorption bestimmter Analyte an unterschiedlichen Oberflächen. Merke: Die Affinität gegenüber Oberflächen hängt nicht nur vom Material der Oberfläche selbst, sondern auch von den chromatographischen Bedingungen ab. Unterschiedliches Material der Kapillare (Peek vs. Stahl) Unterschiedliches Material der Nadel (Stahl vs. Messing vs. Titan vs. Peek vs. Keramik) auch…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized, Verweilvolumen

„Dreck“ bzw. Matrix mal anders… „Dreck“ in einer HPLC-Anlage ist unangenehm, jener kann unterschiedlichen Ursprungs sein: Matrixbestandteile, Verunreinigungen aus der Probelösung oder dem Eluenten, Polymere aus dem Acetonitril, Kontaminationen aus dem Gerät etc. Eluiert der „Dreck“ einmalig oder unregelmäßig mit der mobilen Phase, lauten die üblichen Probleme: Geisterpeak(s), „Buckel“, „Wellen“, „Gebirge“ in der Basislinie, verstärktes Rauschen. Haftet er jedoch irreversibel oder auch länger an diversen Oberflächen wie Fritten, Injektionsnadel, Septum, Verbindungsstücke, „column saver“ (on-line Filter vor der Vorsäule) etc., müssen wir in diesem Fall mit einer weiteren Konsequenz rechnen: Memoryeffekt bzw. Retentionszeitverschiebung. Nachfolgend zwei Beispiele zur Retentionszeitverschiebung: In PV´ s…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Totvolumen, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der…

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Der Einfluss des Probelösungsmittels auf das Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Doppelpeaks, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Probenlösungsmittel, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Ist die Probelösung nicht identisch mit der mobilen Phase (bzw. mit der Anfangszusammensetzung vom Eluent A bei der Gradientelution) kann dies einen Einfluss auf das Chromatogramm haben. Wie macht sich das nun genau bemerkbar? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: „Andere“ Probelösung kann vielerlei bedeuten: Andere Zusammensetzung, anderes organisches Lösungsmittel, anderer pH-Wert, andere Pufferstärke/anderes Salz etc. Konzentrieren wir uns auf die RP-Chromatographie und betrachten folgende drei Fälle: Die Probelösung kann polarer, apolarer oder einfach „anders“ als der (Anfangs-)Eluent sein. 1. Polarer – also im Sinne der RP-Chromatographie schwächer Diese Situation sollte stets angestrebt werden, denn: Wenn…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, HPLC-Tipps, Uncategorized, Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Degasser Große Variationskoeffizienten Vorsicht beim Degasser! Degasser sind praktisch. Nichtdestotrotz sollte man an bestimmte Sachen denken: Die Effektivität des Entgasens ist abhängig vom Fluss, je geringer der Fluss, umso besser arbeitet ein Degasser Schläuche zum Ersten: Die Schläuche werden mit der Zeit porös – vor allem, wenn häufig mit Puffer gearbeitet wird. Betrachten Sie bitte die Schläuche/Membrane als Verschleißteile, je nach verwendeter mobiler Phase sollten sie alle 3-4 Jahre evtl. ausgewechselt werden Schläuche zum Zweiten: Haben Sie trotz gründlichem Spülen ein Problem mit Geisterpeaks? Es kann sein, dass dies mit den Schläuchen im Degasser zusammen hängt. Nicht nur wg. Weichmacher…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Luft entfernen Bessere Wiederfindungsrate Stärkeres Rauschen oder Geisterpeaks immer um 17.00 Uhr oder nur „gestern“… 1. Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Bekanntlich sehen die Peaks beim Gradienten normalerweise schön aus: Schmal, symmetrisch, im Idealfall bleibt die Peakbreite bei allen Peaks konstant. Nehmen wir jetzt an, Sie fahren einen Gradienten im HILIC-Modus. An einigen Bereichen des Chromatogramms sehen die Peaks gut aus, an einigen Bereichen wiederum erhalten Sie breite Peaks. Mögliche Erklärung: je nach aktueller Eluentenzusammensetzung, die in diesem Moment die Säule erreicht, kann bei der Wechselwirkung der Substanz(en) mit den funktionellen…

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