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HPLC-Tipps

Peaky und Chromy in der Säule

Von HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Dezember Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen, es ist eine Zeit her, dass wir den kleinen Peaky Säure und den großen Chromy von Hydrophobenhausen haben zu Wort kommen lassen. Nun ist es wieder soweit, horchen wir Ihnen einfach – nur wo sind sie denn? Klar doch: Peaky der schnelle und Chromy der langsame schlendern gemütlich durch die Säule. Peaky: Du Chromy, ich bin soooo froh, dass wir keine Maske tragen müssen. Unser Abstand zwischen uns ist soooo groß, da kann wirklich nichts passieren, juhu! (Peaky zeigt dem Corona-Virus frech die Zunge und hantiert noch an seine Nase herum). Chromy:…

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Die Kleinen im Sommer: Permanent auftretender Geisterpeak, Faustregeln zu Log P und Log D, Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache

Von A Fehlersuche, Auflösung, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Systemeignungstest (SST), Uncategorized

  Permanent auftretender Geisterpeak Faustregeln zu Log P und Log D Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache Seit kurzem erscheint ein Geisterpeak bzw. stets ein Blindwert im Blank… Seit einiger Zeit taugt bei einer Methode – oder bei mehreren – die noch vor kurzem keine Probleme machte(n), ein Geisterpeak auf. Oder aber, Sie haben in Ihrem Blank auf einmal stets einen Blindwert. Und dieses Problem haben Sie unabhängig von der Anlage, dem/der Anwender(in) und sogar der Methode. D.h. das übliche Fehler-Ausschluss-Programm haben Sie gründlich aber leider erfolglos absolviert. Versuchen Sie in einem solchen Fall im Team sich zu erinnern,…

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Regulierter Bereich, feststehende Prüfvorschrift, geforderte Auflösung wird nicht erreicht – was ist möglich?

Von Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten in einem regulierten Bereich und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welche regel-konforme Handgriffe kämen in Frage? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles – von der Eluentenzusammensetzung bis zu den Einstellungen („Settings“) – vorgegeben, so können Sie de facto es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule,…

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Effektives Spülen einer HPLC-RP-Säule – und Verifizierung des Erfolges

Von HPLC-Tipps, HPLC-Tipps Demo, Spülen, Reinigen & Equilibrieren
Der Fall Eine RP-Säule sollte ab und an gespült werden; erfahrene AnwenderInnen wissen wie, z. B: „Übliche“ Spülprozedur, oft vollkommen ausreichend: 70-80% Acetonitril (ACN)- oder Methanol (MeOH)-Wasser-Gemisch Imfalle von polaren Verunreinigungen: 90-95% H2O, Rest: ACN oder MeOH Imfalle von apolaren Verunreinigungen: 80-100% ACN oder MeOH Soweit, so gut – nur: Bei unbekannten Verunreinigungen müsste man – um des Erfolges sich recht sicher zu sein – einmal mit „viel“ Wasser und einmal mit „viel“ ACN spülen, was schon zeitaufwendig ist. Ferner: Bei unbekannten Verunreinigungen und/oder „schwieriger“ Matrix ist man nach etwaiger Spülprozedur doch unsicher, in wieweit sie erfolgreich verlaufen ist. Gibt...
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Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen/erniedrigen?  

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säule, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über folgenden Tatbestand unterhalten: Wenn ich in der HPLC einen physikalischen Parameter verändere, ist das Ergebnis selten eindeutig „gut“ oder „schlecht“. Je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen überwiegen Vor- oder eben Nachteile. Dies gilt analog auch für chemische Parameter. Hier wollen wir stellvertretend sechs solcher betrachten, siehe Tabelle 1. Die Lösung   Was Nachteile Vorteile Erhöhung der Temperatur In der Regel Abnahme der Selektivität und der Lebensdauer der Säule, ferner erhöhte Gefahr für  Zersetzung von thermolabiler Analyten Abnahme der Retentionszeit und des Druckes, Verbesserung der Peakform und dadurch Zunahme der Peakkapazität (Anzahl der…

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Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen?  

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, HPLC-Tipps Demo, Säule, Verweilvolumen
Der Fall Selten sind Eigenschaften eindeutig nur als positiv oder als negativ zu bezeichnen. So hat ein Ferrari zwar Vorteile. Wenn ich allerdings mit diesem Vehikel und mit meinen vier Kindern und mit meiner Schwiegermutter und mit unserem Hund Mitte August nach Griechenland fahren will, wird es gelinde gesagt mindestens „interessant“…Genauso verhält es sich mit Änderungen. Sie bescheren selten nur „gute“ oder nur „schlechte“ Ergebnisse, so auch in der HPLC: Wenn ich einen Parameter verändere, ergeben sich je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen Vor- oder eben Nachteile. In Tabelle 1 finden Sie sechs physikalische Parameter mit einer differenzierten Betrachtung deren Auswirkungen....
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Zusätze in der Probelösung  

Von Auflösung, B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized

Der Fall Additiva (Modifier) oder einfache Zusätze wie Salze in der mobilen Phase können die Trennung positiv beeinflussen, ihr Einsatz bewährt sich seit Jahrzehnten. So kann beispielsweise die Peaksymmetrie und dadurch indirekt die Empfindlichkeit durch Verwendung von etwa Di- oder Triethylamin, DEA/TEA, Di-Tri- oder Fluoressigsäure, DFA/TFA/FA, Ionenpaarreagenzien wie Heptan- oder Oktansulfonsäure erhöht werden. Das Problem dabei: Solche Additiva werden teilweise an der Oberfläche der stationären Phase (irreversibel) adsorbiert, was in der Routine vielleicht ein geringe(re)s Problem darstellt. In der Methodenentwicklung jedoch ist dies störend, weil ja nach jedem Experiment die Säule mühsam durch Spülen wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht…

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Die „Kleinen“ im Sommer… Die Themen:  Lösungsmittel, Teilchengröße, Gradient

Von Eluent, Fritten, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Uncategorized

Zur Qualität von Lösungsmitteln für die HPLC – wann, was? Sowohl „Gradient grade“ als auch „LC-MS grade“ sind sehr reine Lösungsmittel – worin liegt nun der Unterschied? Wie die Bezeichnung es ahnen lässt: Gradient grade Lösungsmittel sind speziell für die spektroskopischen Detektoren (Fluoreszenz- und vor allem UV-Detektor) optimiert, sie sind frei von organischen Verunreinigungen. Das Ziel dabei ist es, dass insbesondere bei Gradientenmethoden gegen Ende des Gradientenlaufs keine Geisterpeaks auftauchen. LC-MS grade ist frei von ionischen Verunreinigungen, da ja jene ein verstärktes Rauschen verursachen würden. Ferner würde ihre Ionisierung zum Empfindlichkeitsverlust führen. Organische Verunreinigungen können hier zwar zugegen sein, die…

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Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Von Apparatur, B Optimierung, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die…

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Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)…

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