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HPLC-Tipps

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Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen/erniedrigen?  

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säule, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über folgenden Tatbestand unterhalten: Wenn ich in der HPLC einen physikalischen Parameter verändere, ist das Ergebnis selten eindeutig „gut“ oder „schlecht“. Je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen überwiegen Vor- oder eben Nachteile. Dies gilt analog auch für chemische Parameter. Hier wollen wir stellvertretend sechs solcher betrachten, siehe Tabelle 1. Die Lösung   Was Nachteile Vorteile Erhöhung der Temperatur In der Regel Abnahme der Selektivität und der Lebensdauer der Säule, ferner erhöhte Gefahr für  Zersetzung von thermolabiler Analyten Abnahme der Retentionszeit und des Druckes, Verbesserung der Peakform und dadurch Zunahme der Peakkapazität (Anzahl der…

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2. Februar 2020

Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen?  

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, HPLC-Tipps Demo, Säule, Verweilvolumen
Der Fall Selten sind Eigenschaften eindeutig nur als positiv oder als negativ zu bezeichnen. So hat ein Ferrari zwar Vorteile. Wenn ich allerdings mit diesem Vehikel und mit meinen vier Kindern und mit meiner Schwiegermutter und mit unserem Hund Mitte August nach Griechenland fahren will, wird es gelinde gesagt mindestens „interessant“…Genauso verhält es sich mit Änderungen. Sie bescheren selten nur „gute“ oder nur „schlechte“ Ergebnisse, so auch in der HPLC: Wenn ich einen Parameter verändere, ergeben sich je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen Vor- oder eben Nachteile. In Tabelle 1 finden Sie sechs physikalische Parameter mit einer differenzierten Betrachtung deren Auswirkungen....
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4. November 2019

Zusätze in der Probelösung  

Von Auflösung, B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized

Der Fall Additiva (Modifier) oder einfache Zusätze wie Salze in der mobilen Phase können die Trennung positiv beeinflussen, ihr Einsatz bewährt sich seit Jahrzehnten. So kann beispielsweise die Peaksymmetrie und dadurch indirekt die Empfindlichkeit durch Verwendung von etwa Di- oder Triethylamin, DEA/TEA, Di-Tri- oder Fluoressigsäure, DFA/TFA/FA, Ionenpaarreagenzien wie Heptan- oder Oktansulfonsäure erhöht werden. Das Problem dabei: Solche Additiva werden teilweise an der Oberfläche der stationären Phase (irreversibel) adsorbiert, was in der Routine vielleicht ein geringe(re)s Problem darstellt. In der Methodenentwicklung jedoch ist dies störend, weil ja nach jedem Experiment die Säule mühsam durch Spülen wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht…

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3. Oktober 2019

Die „Kleinen“ im Sommer… Die Themen:  Lösungsmittel, Teilchengröße, Gradient

Von Eluent, Fritten, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Uncategorized

Zur Qualität von Lösungsmitteln für die HPLC – wann, was? Sowohl „Gradient grade“ als auch „LC-MS grade“ sind sehr reine Lösungsmittel – worin liegt nun der Unterschied? Wie die Bezeichnung es ahnen lässt: Gradient grade Lösungsmittel sind speziell für die spektroskopischen Detektoren (Fluoreszenz- und vor allem UV-Detektor) optimiert, sie sind frei von organischen Verunreinigungen. Das Ziel dabei ist es, dass insbesondere bei Gradientenmethoden gegen Ende des Gradientenlaufs keine Geisterpeaks auftauchen. LC-MS grade ist frei von ionischen Verunreinigungen, da ja jene ein verstärktes Rauschen verursachen würden. Ferner würde ihre Ionisierung zum Empfindlichkeitsverlust führen. Organische Verunreinigungen können hier zwar zugegen sein, die…

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6. Juli 2019

Der RP-Gradient – eine „andere“ Welt…

Von Apparatur, B Optimierung, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Chromatographische Gesetzmäßigkeiten gelten grundsätzlich stets, unabhängig davon, ob es sich um HPLC, IC oder GC handelt. Und natürlich auch, ob isokratische oder Gradiententrennungen vorliegen. Jedoch gibt es bei LC-Gradienten einige Charakteristika, die schon etwas „eigen“ sind und sie man sinnvollerweise im Kopf behalten sollte. Dies hilft im Alltag, Ergebnisse richtig zu deuten und Vorhersagen bei Optimierungsläufen ein wenig sicherer zu treffen. Schauen wir uns nun zwei-drei typische an. Die Lösung Vorbemerkung: Die weiter unten aufgeführten Hinweise sind mit Hilfe entsprechender Formeln leicht zu belegen. Wir verzichten allerdings an dieser Stelle auf „Mathematik“ und konzentrieren uns lediglich auf die…

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1. Juni 2019

Andauernde Probleme beim Methodentransfer? Ein Reisegrund…

Von A Fehlersuche, Apparatur, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Methode wird transferiert. Trotz idealen Voraussetzungen, das wären beispielsweise identische Hard- und Software in den beteiligten Labors, qualifizierte Geräte, vorhandenes Know-how der AnwenderInnen hier und dort usw. sind die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend. Die auftretenden Probleme können vielfältiger Natur sein: Starkes Basislinie-Rauschen, Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen etc. Mehrere E-Mails oder auch Video-Valls bringen keine wirkliche Lösung. Was ist zu tun? Die Lösung Gleich zu Beginn meine Empfehlung: Handelt es sich um eine wichtige Methode und ist das Problem nach drei bis vier E-Mails/Video-Calls nicht zu lösen? Fahren/fliegen Sie hin. „Sie“ ist der/die Anwender(in)…

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3. Mai 2019

HPLC im Frühjahr… 

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Auto-Sampler, Detektor, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche…

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2. April 2019

Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Von Apparatur, B Optimierung, Bodenzahl, Einstellparameter, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Probenlösungsmittel, Totvolumen

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun…

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1. März 2019

Sind neben Systemeignungstests (SST) weitere Tests notwendig bzw. sinnvoll?

Von Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Mithilfe von SSTs wird überprüft, ob diese Methode an diesem Gerät „hier und jetzt“ funktioniert. Ob also die Anforderungen an diese Methode erfüllt werden oder eben nicht. Als Forderung kann beispielsweise ein bestimmter Wert für die Auflösung eines kritischen Paars oder die Bestimmungsgrenze für eine Nebenkomponente gelten. Sind weitere Tests notwendig zumal ja die Zeit immer knapper wird? Die Lösung Sicherlich gibt es hier unterschiedliche Vorstellungen. Nachfolgend meine persönliche Meinung und davon ableitend ein Vorschlag: Ein gut designter SST beinhaltet die Information, die ich brauche. Passt er, so ist nichts mehr zu tun. Passt er nicht, so wären…

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2. Oktober 2018

Die Kleinen im Sommer – Ursachen für Geisterpeaks

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Der Fall Geisterpeaks sind immer wieder ein Problem – leider. Obschon häufig behandelt, möchte ich erneut das Thema aufgreifen und weiter unten ein paar eher seltenere Ursachen für plötzlich auftauchende Peaks schildern. Welche wären das? Die Lösung Vorbemerkung: Bei auftretenden Problemen frage ich die KollegInnen generell als erstes: „Habt ihr irgendetwas geändert, gab es etwaige räumliche Änderungen/Ereignisse, die mit dem Auftauchen des Problems zeitlich zusammen fallen“? Und dann kommt als Antwort, oft viel zu schnell: „Nein“. Bevor dieses „nein“ kommt, überlegen Sie sich bitte, ob vielleicht doch HPLC-relevante Sachen geändert wurden bzw. etwas „aus-der-Reihe“ passiert ist oder einfach anders läuft….

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6. September 2018