Peaky hatte im HPLC-Tipp von Januar/Februar 2022 Chromy diversen Antworten präsentiert und Chromy sollte je eine passende Frage dazu formulieren. Selbstverständlich gibt es mehrere mögliche Fragen; nachfolgend Beispiele von „richtigen“ Fragen zu den Antworten inkl. kurzer Erläuterung:

„Was muss die Ursache sein, wenn Retentions- und Totzeit sich ändern?“

  • „Es kann nur der Fluss sein, weil wir keine längere Säule eingebaut haben“Die Totzeit (Zeit einer inerten Komponente) ändert sich nur, wenn physikalische Faktoren wie Fluss und Säulendimensionierung sich ändern.

„Was ist die Ursache für eine suboptimale Peakform bei Komponente X, wenn die Injektion einer neutralen Komponente wie beispielsweise Toluol einen symmetrischen Peak liefert?“

  • „Es kann für die Bandenverbreiterung bzw. Tailing dieser stabilen Komponente X nur eine pH-Wert-Verschiebung oder Komplexbildung in Frage kommen; Verschlechterung der Packungsqualität oder ein Totvolumen in der Apparatur können wir ausschließen“

Schlechte Packungsqualität und Totvolumen sind Substanz-unspezifische Problemquellen. Liegt eine solche vor, so ergibt sich stets – unabhängig von der Natur der injizierten Komponente – eine schlechte Peakform.

„Warum müssen die Substanzen in dieser Probe stark polar sein?“

  • „Weil die Substanzen an dieser stark hydrophoben C18-Säule trotz 90 % Puffer im Eluenten sehr früh eluieren“Wenn trotz geringer Konkurrenz um die Gunst der C18-Borsten seitens der Moleküle in der mobilen Phase (nur 10 % organischer Anteil) Substanzen an den hydrophoben C18-Borsten kaum haften können, müssen sie wohl sehr polar sein.

„Wieso tippst du auf eine Änderung der Flussrate?“

  • „Weil bei Verwendung unseres UV-Detektors die Peakfläche, jedoch kaum die Peakhöhe sich geändert hat“Bei einer Änderung der Flussrate ändert sich im Falle eines konzentrationsempfindlichen Detektors, wie dem UV, nur die Peakfläche. Im Idealfall ändert sich die Peakhöhe überhaupt nicht, in der Praxis schon ein wenig.

„Wieso bist du sicher, dass sie eine isokratische Methode verwendet haben?“

  • „Die Elutionsreihenfolge ändert sich bei einer Änderung der Flussrate nicht – deswegen weiß ich es“Physikalische Parameter wie Säulenlänge, Fluss und Totvolumen beeinflussen im isokratischen Modus die Elutionsreihenfolge nicht. Im Gradientenmodus kann eine Änderung solcher mitunter zu einer Änderung der Elutionsreihenfolge führen. Merke: Bei einer Gradientenanlage spielt nicht das Totvolumen sondern das Verweilvolumen die entscheidende Rolle.

„Warum verwendest du für polare Komponenten im Eluenten Methanol statt Acetonitril?“

  • Weil Methanol in solchen Fällen häufig die bessere Selektivität aufweist“Die Erklärung steckt bereits in der Antwort: Für polare Komponenten ist die Selektivität in Methanol meist besser als in Acetonitril: Methanol unterbindet polare Wechselwirkungen nicht

„Warum vermeidest du für Routinemethoden nach Möglichkeit polare RP-Phasen?“

  • „Sie machen im Alltag generell mehr Probleme, auch deren Chargenreproduzierbarkeit lässt zu wünschen übrig“Auch hier steckt in der Antwort ein bekanntes Dilemma: Polare stationäre Phasen – ob lediglich welche mit polaren Gruppierungen oder auch Mixed Mode Phasen – sind zwar bzgl. Selektivität sehr interessant, bereiten jedoch häufiger Probleme als klassische C18-Phasen.

„Warum überprüft ihr bei jeder neuen Charge vials und Septen? Ist es nicht ein wenig übertrieben?“

  • Wir haben des Öfteren festgestellt, dass – neben der Injektionsnadel und der Purgeflüssigkeit – ihr Einfluss auf Peakform und Flächenreproduzierbarkeit enorm sein kann“Die Beschaffenheit der Glasoberfläche bei vials und die Art der Septen (dunkel- vs. hellrot, Silikoncharge etc.) können tatsächlich viel bewirken, bis hin zu (temporären) Geisterpeaks.