Der Fall Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein? Die Lösung Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät 2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“ Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung ∆ Integrationsalgorithmus, ∆…
Optimale Zeitpunkt für die Elution der wichtigsten/kritischen Peaks
Lagerung in MeOH/ACN
Isokratische Stufe beim Gradienten im Fall von kurzen Säulen
„Optimale“ Elution – wann sollen meine wichtigsten Peaks eluieren?
Zunächst direkt die Aussage: Die optimale Elution für die interessierenden Peaks liegt nach ca. der drei bis fünffachen Totzeit („Front“, Injektionspeak). Sehen Sie zu, dass – wenn irgendwie möglich – wichtige/kritische Peaks bei einem Retentionsfaktor, k (k: Maß für die Stärke der Wechselwirkungen), von etwa drei bis fünf eluieren, d.h. eben nach der drei bis fünffachen Totzeit. Warum? Hier drei Gründe: 1. Ab hier etwa fängt der robuste Bereich an. Die Konsequenz: Konstante Retentionszeiten in der Routine; kleine ungewollte Veränderungen beim Eluenten oder bei der Temperatur wirken sich kaum aus 2. Dieser Bereich entspricht einem optimalen Bereich der Wechselwirkungen. Die Konsequenz: Optimaler Beitrag von k sorgt für eine gute Auflösung 3. In diesem Bereich ergibt sich eine gute Effizienz (gute Bodenzahl). Die Konsequenz: Keine übermäßige und damit störende Peakverbreiterung
In Methanol/Wasser gelagerte Säulen
Für längere Zeiträume (mehrere Wochen/Monate) eignen sich zur Lagerung von polaren RP-Phasen eher ACN/H2O- (mehr als ca. 60 % ACN) als MeOH/H2O-Gemische. Begründung: In einem ACN/H2O-Gemisch ist die Gefahr der Abspaltung durch Hydrolyse von kleinen, polaren funktionellen Gruppen, z. B. C8, C4, Diol, CN, PFP, Phenyl-Hexyl usw. – also das bekannte „Bluten“ der Säule – nahezu unerheblich. 100% Methanol dürfte dagegen unkritisch sein. Soweit, so gut. Nun, einige Hersteller liefern ihre Säulen in MeOH/H2O. Was kann jetzt passieren? Sie arbeiten mit einer recht polaren RP-Säule und die Trennung funktioniert bestens. Sie bestellen beim gleichen Hersteller erneut die gleiche Säule, mit dem Herstellerhinweis, dass es sich um die gleiche Charge wie bei der ersten Säule handelt, dennoch sieht Ihr Chromatogramm „scheußlich“ aus. Es mag sein, dass es sich um die gleiche Säulen-Charge handelt. Die zweite jedoch war beim Hersteller eventuell längere Zeit gelagert. Ein Teil der polaren funktionellen Gruppen, siehe weiter oben, ist womöglich abgespalten und man erhält im Fall von basischen Komponenten beispielsweise stark tailende Peaks, denn: Jene interagieren nun mit frei gewordenen aktiven Silanolgruppen.
„Gleiche“ Charge ist nicht für jeden dasselbe…
Es ist zweifelsohne sinnvoll, im Rahmen der Methodenentwicklung oder später bei der Validierung drei Säulenchargen auszutesten. Hier ist Vorsicht geboten: Wenn Sie beim Hersteller drei Säulen aus drei „verschiedenen Chargen“ bestellen, bekommen Sie meist tatsächlich drei Säulen aus drei unterschiedlichen Herstellungsschargen. Für manchen Hersteller jedoch bedeutet „unterschiedliche Chargen“, dass die Säulen zu unterschiedlichen Zeitpunkten gepackt worden sind, sie sind jedoch aus der gleichen Herstellungscharge…
Denke an MeOH bzw. MeOH/ACN-Gemische
Wasser aus dem Eluenten wird an der Oberfläche von polaren, stationären Phasen adsorbiert. Bei der Trennung von polaren Komponenten wirkt sich dies positiv aus. Als organisches Lösungsmittel eignet sich bei Trennungen von polaren Komponenten tendenziell eher Methanol als Acetonitril. Erwarten Sie nicht ausschließlich stark polare Komponenten sondern auch moderat-polare und evtl. auch neutrale (apolare) Komponenten? Für diesen Fall folgender Vorschlag: Wenn Sie Ihren Gradienten beispielsweise mit 20% B starten und auf 80% B hochfahren möchten, könnten Sie mit 10% MeOH/10% ACN starten und dann auf 40% MeOH/40% ACN hochfahren: Sie nutzen in diesem Fall die gute polare Selektivität durch das Methanol und die gute Peakform durch das ACN (geringe Viskosiität, scharfe Peaks). Generell gilt: Eine ternäre Mischung, also Wasser bzw. Puffer-ACN-MeOH, erweist sich bei einer großen Polaritäts-Bandbreite der Komponenten in der Probe oft als vorteilhaft. Dies gilt auch und gerade bei isokratischen Trennungen.
Großes Verweilvolumen und kleines Säulenvolumen…
Ein großes Verweilvolumen („Dwell“- oder „Delay-Volume“) bei einer Gradientenanlage bedeutet, dass zu Beginn des Gradienten eine isokratische Stufe vorgeschaltet ist. Eine solche mag mitunter etwas Positives bewirken: Manche Peaks am Chromatogramm-Anfang werden besser abgetrennt, als wenn der Gradient „sofort“ an der Säule wäre und dort direkt wirkte. Bei einer kurzen Säule jedoch „sieht“ der Gradient im Fall eines längeren isokratischen Schrittes am Anfang nur einen Teil der Säule, d.h. es werden im schlimmsten Fall nur 50% der Säulenlänge ausgenutzt. Die Peaks werden nach hinten „gestaucht“, bei mehr als 10-15 Peaks werden die letzten Peaks evtl. schlecht abgetrennt.
Der Fall Die wenigsten Anwender führen Säulentests durch – wenn doch, dann wird oft die Bodenzahl ermittelt, man interessiert sich für die Frage: „Ist die Säule noch „gut“?“. Die Mehrzahl führt eher einen Systemeignungstest (SST) durch, in diesem Fall ist die Säule ein Teil des „Gesamtsystems“. Dennoch kommen oft Fragen bzw. Zweifel auf, in etwa: „Reicht das, was wir machen?“ oder: „Wann ist die Säule nicht mehr zu gebrauchen?“ Mit diesen Fragen wollen wir uns hier beschäftigen. Die Lösung Säulentests können Informationen zu folgenden Attributen einer HPLC-Säule liefern: 1. Trennleistung (Sprich: Packungsqualität), 2. Eigenschaften der stationären Phase, 3. Selektivität/Eignung für…
Der Fall Wir wissen alle, was der Unterschied zwischen isokratischen und Gradientrennungen ist: Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung des Eluenten während der Gesamttrennung konstant, bei Gradiententrennungen erhöht sich permanent die Elutionsstärke; so nimmt beispielsweise bei RP-Trennungen vom Anfang bis Ende des Laufs der MeOH- bzw. ACN-Anteil der mobilen Phase zu – die Wechselwirkungen zwischen Eluent und stationärer Phase nehmen ebenfalls zu – und die Peaks werden nach vorne „geschoben“. So weit so gut. Wo liegen nun aus praktischer Sicht die Unterschiede zwischen beiden Trennmodi? Die Lösung Der Unterschiede gibt es zu Genüge, nachfolgend die Wichtigsten inkl. kurzer Kommentierung: Peakform…
Der Fall In der Routine werden AnwenderInnen immer wieder mit folgender Situation konfrontiert: Die Lebensdauer manch´ einer Säule lässt zu wünschen übrig. Und dies obwohl die Methode validiert und die Robustheit überprüft worden ist. Der Grund liegt oft darin, dass bei der Überprüfung der Robustheit einer Methode zwar Methodenparameter wie pH-Wert, Eluentenzusammensetzung, Säulencharge, Temperatur etc. im Focus stehen, die Säulenstabilität jedoch nicht als prüfenswert erachtet wird. Das Ergebnis: Eine wunderbar selektive Säule erweist sich ob ihrer geringen Lebensdauer für einen Routineeinsatz einfach als ungeeignet. Wie kann nun die Säulenstabilität geprüft werden? Die Lösung Man bedient sich eines 3-Stufen Plans: 1….
Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, es weihnachtet…Lassen Sie uns auf eine etwas unkonventionelle Art und Weise ein paar Vorsichtsmaßnahmen wiederholen, die zur merklichen Verlängerung der Lebensdauer einer RP-Säule führen – die Säule meldet sich heute selbst zu Wort und bekundet auf ihre typisch unbekümmerte Art ihre Wünsche. Hallo, ich bin deine Säule! Danke, dass du mich gekauft hast; wir werden viele glückliche Wochen und Monate miteinander verbringen – aber nur, wenn du gaaanz lieb zu mir bist! Denk bitte daran, ich mag keinen Druck – übrigens genauso wie du… – aber ein Sensibelchen bin ich auch wiederum nicht: Ca. 350-380 bar…
Der Fall Nehmen wir an, die beste Selektivität erzielen Sie bei einem pH-Wert von ca. 1,5-2 bzw. 9-10. Ihre Säule ist in diesem Fall in der Regel nicht sonderlich begeistert: Im Sauren besteht die Gefahr der Abspaltung der funktionellen Gruppe(n) durch Hydrolyse („Bluten“ der Säule) – jene Gefahr ist um so größer je kürzer/polarer die funktionelle(n) Gruppe(n) ist/sind. Im Alkalischen kann das Kieselgel sich auflösen. Was tun nun, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig einige Empfehlungen für beide Fälle: 1. Arbeiten im Sauren Säule: Verwenden Sie möglichst Zorbax SB oder eine Hybrid-Säule (siehe weiter unten)…
Der Fall Bei der Trennung von ionischen Analyten in der Routine sind gepufferte Eluenten unerlässig. Die Reproduzierbarkeit ist durch ihren Einsatz generell besser. Dennoch gibt es immer wieder Probleme: Mangelnde Stabilität von Retentionszeiten, Änderung der Peakform, geringe Lebensdauer der Säule. Was sind die Ursachen dafür? Die Lösung Denken Sie bitte an folgende Fehlerquellen: Falscher Puffer zu eingestelltem pH-Wert: Z. B. Phosphatpuffer bei pH=5. Zu schwacher Puffer: Z. B. Trennung von starken Basen und Verwendung eines 5 oder 10 mMol-Puffers – 20 mMol wäre „sichererer“. Messung in einem Bereich von +/- 1 pH-Einheit von pKs- Wert der Komponente. Z. B.Trennung von…
Der Fall Sie haben eine Trennung mit einer guten Auflösung erzielt. Die nächste Frage könnte (sollte!) wie folgt lauten: „Wie kann ich am unproblematischsten die Analysenzeit verkürzen?“ Die Lösung Ganz einfach: Fluss erhöhen. Es ist mir bewusst, dass vielen LeserInnen diese Antwort recht banal erscheint. Im Grunde genommen ist sie es auch. Dennoch macht es Sinn darauf hinzuweisen, denn es existieren für meine Begriffe weltweit einfach viel zu viele Prüfvorschriften mit „Fluss: 1 ml/min“. Eine Flusserhöhung führt stets zu Zeitersparnis oder beim Gradienten sogar zur Verbesserung der Auflösung (siehe weiter unten), die Nachteile, die man sich einhandelt, sind gering –…
Der Fall Die Erfahrung lehrt, dass mit der Zeit die Qualität einer HPLC-Säule abnimmt, die Peaks werden breiter. Ist auch der umgekehrte Fall denkbar? Die Lösung Ja. Halten wir nun folgendes fest: Die Aussage, „die C18-Säule ist schlechter geworden“ kann zweierlei bedeuten. Zum einen kann es sich um eine mechanische Beanspruchung der Packung handeln, deren Ausmaß im wesentlichen von dem Fluss, dem Druck, der Temperatur, der Anzahl der Injektionen und dem Betriebsmodus (isokratischer-/Gradientenbetrieb) abhängt. Lässt nun die Qualität der Packung nach, so manifestiert sich dies mit Peakverbreiterung und/oder Tailling, evtl. sogar mit Doppelpeaks – die Retentionszeit bleibt dabei konstant. Zum…
