A FehlersucheApparaturEinstellparameterJahrestippsLebensdauer der SäulePeakverbreiterungTotvolumen

Zwei identische Anlagen, isokratischer Lauf, unterschiedliche Ergebnisse – mögliche Ursachen

Von 31. März 2022 Mai 27th, 2022 No Comments

Der Fall

Sie übernehmen eine isokratische HPLC-Methode; Ihre Anlage ist baugleich mit der Anlage an der die Methode entwickelt worden ist, die Prüfvorschrift ist recht ausführlich. Dennoch gibt es Probleme, z. B. Retentionszeit(en), Peakform- und/oder -fläche ist(sind) unterschiedlich, ferner: Die Säule hält nicht so lang. Was können die Ursachen sein?

Die Lösung

Erwartungsgemäß gibt es viele mögliche Gründe. Jene können u.a. grob in zwei Kategorien eingeteilt werden:

1. Es fehlen Details zum Handling bzw. zum Gerät
2. Unterschiede in der Handhabung apparativer „Feinheiten“

Nachfolgend werden einige typische Beispiele für beide Kategorien aufgeführt.

  1. Fehlende Detailangaben in der Prüfvorschrift/Methodenbeschreibung
  • ∆ Integrationsalgorithmus, ∆ Einstellparameter, z. B. 5 Hz oder 20 Hz
    (∆ Peakfläche, ∆ Peakform)
  • Wird womöglich ein Säulenschaltventil verwendet und ergibt sich dadurch ein größeres Totvolumen? (∆ Peakform)
  • Noch „schlimmer“: Nehmen wir an, das Totvolumen der Apparatur („extra column volume“) ist angegeben, Ihre Anlage weist nahezu das gleiche Totvolumen aus. Trotzdem ergibt sich eine andere Peakform. Erklärung: Für die Bandenverbreiterung ist im Grunde genommen nicht das Totvolumen sondern das Dispersionsvolumen verantwortlich und jenes ist von der 4. Potenz des Kapillarinnendurchmessers abhängig. Wir möchten hier nicht in mathematischen Tiefen abdriften, merke daher lediglich: Bei gleichem geometrischen (Tot)Volumen ist eine lange und dünne Kapillare einer kurzen und dicken vorzuziehen; bei zweiter Variante ist das Dispersionsvolumen nämlich kleiner
  • Ist der Eluent bereits vorgemischt oder übernimmt das Gerät das Mischen?
    (∆ Retentionszeit)
  • Genaue Positionierung der Säule in einem Umluftofen (∆ Retentionszeit, evtl. ∆ Peakform)
  • In einem Labor werden die Proben angesetzt und man startet direkt die Sequenz. In einem anderen Labor werden viele Proben für mehrere Messplätze von einer Person angesetzt, anschließend werden sie verteilt. Im zweiten Fall befinden sich die Proben eine längere Zeit in den vials. Je nach Beschaffenheit der Glasoberfläche kann sich der pH-Wert einer wässrigen Probelösung nach einer Stunde im vial um mehr als eine pH-Wert-Einheit ändern. Oder aber im ersten Labor ist die Sequenz viel kürzer als im zweiten
    (∆ Retentionszeit, ∆ Peakform, evtl. ∆ Peakfläche)
  • Saphir- oder Keramikkolben? (Anfälligkeit gegenüber Salzen, Leckage möglich, dadurch ∆ Eluentenzusammensetzung und folglich ∆ Retentionszeit)
  1. Unterschiedliche Handhabung der Anlage

Die meisten modernen UHPLC/HPLC-Anlagen verfügen über nützliche Funktionen, die allerdings manchmal bewusst aktiviert werden müssen, nachfolgend einige Beispiele:

  • In einem Fall werden Luftblasen zur Vermeidung von Peakverbreiterung auf dem Weg der Probe vom Probengeber zur Säule erzeugt, im anderen Fall ist diese Funktion deaktiviert (∆ Peakform)
  • Ebenso: Kompressibilitätskorrektur „on“/“off“; automatische Korrektur oder muss jene manuell aktiviert werden? (∆ Peakform)
  • „Cooling“-Funktion (um zu verhindern, dass die Probe nach der Säule „warm“ am Detektor ankommt) aktiviert/nicht-aktiviert (∆ Peakform)
  • Läuft der Eluent permanent oder erfolgt während der Injektion eine Unterbrechung? Im zweiten Fall erfasst nach jeder Injektion eine Druckwelle die Säule (∆ Lebensdauer der Säule)
  • Wird die Ansaug- und Injektionsgeschwindigkeit automatisch der Viskosität der Probelösung angepasst? (∆ Präzision)

Das Fazit

Oft sind solche „Kleinigkeiten“ nur vor Ort zu entdecken. Oder aber man hat Glück und kommt bei einer „penibel-höfflichen“ Fragerei während eines Calls dahinter…