Der Fall
Eine Methode läuft an zwei identischen HPLC-Anlagen. Eine der zwei Anlagen erzeugt problematische Chromatogramme, z. B. Drift der Basislinie, „Buckel“ oder Geisterpeaks. Woran kann es liegen?
Die Lösung
Bemerkung:
Die hier besprochenen Probleme machen sich insbesondere bei niedrigen Wellenlängen und bei hochauflösenden Massenspektrometern bemerkbar.
Eine mögliche Erklärung wäre folgende: An der Anlage, die keine Probleme bereitet, wird Lösungsmittel aufgefüllt, sobald das Reservoir ca. zur Hälfte geleert ist. An der „problematischen“ Anlage wird gewartet bis das Lösungsmittelreservoir fast leer ist, um es wieder aufzufüllen, Ergebnis: Das letztgenannte Handling kann zu unterschiedlicher Konzentration an Störsubstanzen führen. Es ergeben sich womöglich folgende Probleme:
- Acetonitril-Reservoir
- Aus Acetonitril kann mit der Zeit Aceton entstehen – und Aceton ist UV-aktiv. Bei geringer Acetonitril-Menge ist die Konzentration an Aceton im Raum über der Acetonitril-Oberfläche hoch, Ergebnis: Leichte Drift, die immer stärker wird
- Unter Lichteinwirkung können in Acetonitril Polymere entstehen. Bei geringer Acetonitril-Menge im Lösungsmittelreservoir ist deren Konzentration hoch, die Konsequenz lautet: „Buckelige“ Basislinie. Ihre Konzentration bei einem halbvollen Lösungsmittelreservoir dagegen ist gering, das Problem ist nicht existent oder marginal
- Ähnlich verhält es sich bei geringer Acetonitril-Menge und vorhandenen polaren Verunreinigungen dort wie Nitrile (insbesondere Imine), Acrylnitril, Ammoniak, Essigsäure. In diesem Fall tauchen Geisterpeaks auf. In minderwertigen HPLC Acetonitril-Chargen sind mehr Verunreinigungen denkbar, nachfolgend ein Überblick:
- Wasser-/Puffer-Reservoir
Analog weiter oben: Wenn eher lang gewartet wird, um das Reservoir mit der wässrigen Phase wieder aufzufüllen und dies im Zusammenspiel mit erhöhter Temperatur und direktem Lichteinfall auf letzteres können Mikroorganismen wachsen. Diese bewirken verstärkt „Buckel“ in der Basislinie, Doppelpeaks bzw. Peak-Schulter/Tailing und Druckschwankungen. Im unangenehmsten Fall kann sich der pH-Wert durch Stoffwechselprodukte erniedrigen. Neben den Folgen für die Trennung bei einem veränderten pH-Wert (insbesondere in der Nähe vom pKS-Wert des Analyten!) kann sich das Auswaschen von Metallionen aus allerlei metallischen Oberflächen verstärken. Metallionen können mit bestimmten Analyten komplexieren, was zu einer Verschlechterung der Peakform und/oder zum Memory-Effekt führen kann.
Das Fazit
Eigentlich recht einfach: Warten Sie mit dem Auffüllen des Lösungsmittelreservoirs nicht zu lange! Noch besser im Falle von Gradientenläufen: Vormischen von A und B. Wasser im Acetonitril-Reservoir verhindert die Bildung von Polymeren, Acetonitril im Wasser-Reservoir das Wachstum von Mikroorganismen. Dass sich darüber hinaus noch eine ruhigere Basislinie und eine bessere Reproduzierbarkeit der Retentionszeit ergeben, sind willkommene Nebeneffekte.
