Der Fall Sie arbeiten mit einem RP-System und folgendem Eluenten: MeOH (oder Acetonitril)/ Kaliumdihydrogen-Phosphatpuffer, pH = 7,5, 45/55 (v/v) und trennen basische Substanzen. Die Trennung ist gut, viel zu gut. Also erhöhen sie – um Zeit zu gewinnen – den Methanolanteil auf 80 % oder Sie fahren einen 40 → 80 % MeOH-Gradienten bei sonst gleichen Bedingungen … und Sie verstehen die Welt nicht mehr: Die Basen kommen nicht einfach früher wie es sich gehört. Nein, alle oder ein Teil davon macht riesige Retentionszeit-Sprünge nach hinten und/oder die Selektivität ändert sich und/oder die Säule hält nicht mehr so lange und so…
Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten organische Verbindungen mit saurem Charakter trennen. Die Rede ist nicht von Aminosäuren oder organischen/anorganischen Säuren. Für diese Substanzklassen existieren sehr gute Standardapplikationen. Bei Ersteren erfolgt die Trennung durch Vor- beziehungsweise Nachsäulederivatisierung und Gradientelution. Letztere werden an starken/schwachen Ionenaustauschern getrennt. Welche RP-Systeme könnten nun in Frage kommen? Die Lösung Man nehme wie folgt: Die Säule Nicht endcappede, „klassische“ Säulen, weil diese im Sauren, siehe weiter unten, stabiler als endcappede sind oder einige moderne, speziell für den Einsatz im Sauren entwickelte Säulen, es sei hier je ein Vertreter genannt: LiChrospher, Zorbax SB. Der Eluent Es…
These: Es ist realistisch, eine Methode innerhalb von zwei Arbeitstagen zu ca. 80% zu entwickeln. Betrachten wir folgenden fiktiven Fall (Siehe für eine kürzer-gefasste Version dieses Konzepts diesen HPLC-Tipp): Der Fall Ihr Chef kommt Dienstag Morgen recht konsterniert ins Labor, überreicht Ihnen eine ganz, ganz wichtige Probe direkt aus der Synthese und fleht Sie an, eine Trennung bis morgen Abend irgendwie hinzukriegen. Er fliegt am Donnerstag früh in die Staaten und bräuchte dringend die Information über die Anzahl der Probenbestandteile, es geht also um qualitative Analyse. Eigentlich ist Ihr Chef ein netter Mensch und das ist nicht seine Art, also…
Der Fall Die unbeabsichtigte pH-Verschiebung im Eluenten ist einer der häufigsten Gründe für mangelnde Robustheit in der RP-Chromatographie. In diesem HPLC-Tipp geht es um die Ursachen für eine pH-Verschiebung sowie über das Ausmaß. Hier wollen wir uns etwas genauer mit der Änderung der Peakgröße befassen. Die Lösung Eine pH-Wert-Verschiebung kann zu unterschiedlicher Signalgröße (Peakfläche) führen, denn die UV-Absorption polarer Komponenten kann pH-Wert abhängig sein. In Abb. 1 wird das Spektrum der L-Ascorbinsäure bei unterschiedlichen pH-Werten gezeigt. Betrachten wir den pH-Wert-Bereich, der für die HPLC relevant ist, pH = 2-9. Im Alkalischen hätten wir beispielsweise bei 240 nm einen kleinen Peak,…
Der Fall Gehen wir von dem Fall aus, dass Sie eine Trennung „hinkriegen“ sollen. Dass die Zeit drängt, brauchen wir nicht zu erwähnen und dass Sie wenig über die Probe wissen, ist ebenfalls logisch….. Dass weiterhin die einzige HPLC-erfahrene Kollegin in Urlaub ist, versteht sich von selbst und der Laborleiter, der zufällig ein HPLC-Experte ist, weilt auf einer HPLC-Tagung und anschließend in Kur. Sie also, mutterseelenallein im Labor, ein Fläschchen mit einem unbekannten Etwas in der Hand und auf dem Schreibtisch ein Zettel mit einem riesigen EILT!. Wie sollte man so etwas anpacken – vorausgesetzt, Sie gehen nicht gleich nach…
Der Fall In der quantitativen HPLC wird der Gehalt nahezu ausschließlich über die Peakfläche bestimmt. Ändert sich die Peakfläche nicht ausschließlich aufgrund einer unterschiedlichen Injektionsmenge/Konentration – wie es ja sein sollte – erhält man falsche Ergebnisse. Wann kann dies passieren? Die Lösung Ursachen für eine Änderung der Peakfläche: Änderung der Injektionsmenge/des Injektionsvolumens, Änderung der Konentration (evtl. ungewollt durch verdampfen von Lösungsmittel…) Änderung des Flusses (konzentrationsempfindliche Detektoren) Änderung der Wellenlänge Änderung des pH-Wertes irreversible Adsorption ungeeignetes Probelösungsmittel Kurze Kommentierung der einzelnen Fälle: 1., 2. und 3. Das sind die Haupteinflussgrößen apparativer Natur, die eine unbeabsichtigte Änderung der Peakfläche und damit zu falschen…
Der Fall Eine RP-Trennung bei einem pH-Wert, sagen wir ca. zwischen 7,5 und 9,5, ist keine Situation, über die man sich freuen könnte. Nehmen wir an, dass aus Selektivitätsgründen der alkalische pH-Wert genauso wie eine Säule auf Kieselgel- und nicht auf Polymerbasis ein „Muss“ ist. Je nach Säulenhersteller gibt es mit der Lebensdauer der Säule kleinere oder größere Probleme, auch die Robustheit leidet möglicherweise darunter. Was könnte man hier tun? Die Lösung Wenn Sie an einer Prüfvorschrift gebunden sind, brauchen wir uns nicht weiter zu unterhalten, arbeiten Sie einfach nach Vorschrift. Haben Sie gewisse Freiheiten, wären folgende Maßnahmen möglich (mit…
Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns bereits mit einem der schwierigsten Problemen in der RP-HPLC beschäftigt, nämlich mit der Trennung von polaren und ionischen Komponenten. Im hiesigen HPLC-Tipp wird dieses Thema weiter vertieft. Spätestens, wenn Sie tailende Peaks erhalten und Sie alle anderen Ursachen ausschließen können, wissen Sie, dass Sie es mit ionischen Substanzen zu tun haben, wobei Basen in der Regel unangenehmer sind als Säuren. Nachfolgend sind einige für die Trennung ionischer Substanzen geeignete chromatographische Bedingungen in Tabellenform aufgelistet. ,,Säule“ und ,,Eluent“ müssen dabei nicht immer streng kombiniert werden, sie können auch einzeln zum Erfolg führen. Die…
Der Fall Einige, mehrere oder alle Peaks in Ihrem Chromatogramm eluieren mit einem Tailing. Die Gründe können vielfältig sein: Säulenüberladung, keine optimale Parametereinstellung am Detektor (z. B. Zeitkonstante, Datenrateaufnahme), größeres Totvolumen im System. Oder hängt es letzten Endes doch mit der Säule zusammen? Nehmen wir an, Sie können die ersten drei Fälle als Ursachen ausschließen und das Totvolumen Ihrer Anlage ist auch in Ordnung. Dann betrifft es doch die Säule. Die Frage ist nur: Was genau an der Säule? Wie kann man das überprüfen und was sind schließlich die notwendigen Maßnahmen? Die Lösung Wenn die oben beschriebenen Fälle als Ursachen…
Der Fall Angenommen, Ihre Peaks kommen in einem C18-ACN/H2O- oder MeOH/H2O-System viel zu früh, sagen wir irgendwo zwischen Totzeit und zweifacher Totzeit. Wenn Sie die Säule nicht überladen haben, dann liegt der Grund wohl darin, dass Ihre Substanzen sehr polar oder sogar ionisch sind. Wie können Sie nun die Retentionszeit erhöhen? Die Lösung Nachfolgend einige Möglichkeiten: Erster Fall: k-Werte (Retentionsfaktoren, relative Retention) sollen konstant bleiben; ,,Chemie“ bleibt konstant, d. h. die Wechselwirkungen mit der stationären Phase ändern sich nicht. Maßnahme: Säulenlänge erhöhen, Fluss erniedrigen Zweiter Fall: Änderung der k-Werte, d. h. es erfolgt ein Eingriff in die Wechselwirkung Substanz-stationäre Phase:…