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Chromatogramm

Ursachen für Drift

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule, Wellenlänge

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von…

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Wie aussagekräftig sind Bodenzahlen?

Von Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps

Der Fall Die Bodenzahl ist bekanntlich ein Maß für die Effizienz (Packungsqualität) einer Säule. Selbstverständlich indirekt auch für die Güte der verwendeten Apparatur, weil ja letztere durch ihr Totvolumen auch zur Bandenverbreiterung beiträgt. Angaben zu Bodenzahlen findet man nun reichlich in der Literatur und – aus Anwendersicht vielleicht am interessantesten – in den Säulenzertifikaten (Belegchromatogramme), die einer neuen Säule stets beigelegt sind. Kann man nun diese Angaben direkt vergleichen, um zu einer Aussage zu kommen in etwa: „Die Säule vom Hersteller X weist eine höhere Bodenzahl, als die vom Hersteller Y auf, also ist erstere besser gepackt“? Die Lösung Nein,…

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Doppelpeaks

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Doppelpeaks, HPLC-Tipps

Der Fall Während eines Laufs bei einer mehr oder weniger bekannten Applikation stellen Sie auf einmal Doppelpeaks fest. Was könnte die Ursache sein? Die Lösung Um es vorweg klar zu stellen: Hier sind keine zusätzliche Peaks gemeint, deren Ursprung eine zweite, nicht-abgetrennte Komponente, Luft, Memory-Effekt, allerlei Kontaminationen usw. sein können, sondern „richtige“ Doppelpeaks. Die wichtigsten/häufigsten Ursachen zusammen mit einigen Kommentaren sind in Tab. 1 zusammengestellt. Bemerkung zum letzten Hinweis: In einem konkreten Fall wurde erst durch die schleichende Änderung des pH-Wertes im Laufe einer langen Messserie erkannt, dass ein Peak, der am Anfang „fantastisch“ ausgesehen hat, eben nicht homogen war….

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Legale Tricks, um eine geforderte Bodenzahl doch noch zu erreichen

Von B Optimierung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Totvolumen

Der Fall Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der Prüfvorschrift einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5.000“. Dass ich der Meinung bin, dass eine derartige Forderung unnötig ist, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausrechende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in…

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Einige Ursachen für negative Peaks

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit

Der Fall Negative Peaks stellen eine ärgerliche Sache dar, die bei einigen Applikationen stets zu beklagen ist oder aber sie tauchen immer wieder völlig unberechenbar auf. Was könnte(n) die Ursache(n) sein? Die Lösung Wie leider Gottes in der HPLC üblich, gibt es eine ganze Reihe von möglichen Ursachen. Nachfolgend werden die häufigsten genannt. Brechungsindex- bzw. Leitfähigkeitsdifferenz Die meisten UV-Detektoren sind nicht Brechungsindex-entkoppelt, d.h. sie registrieren eine eventuelle Differenz zwischen dem (konstanten) Brechungsindex des Eluenten und dem Brechungsindex des Eluentensegments, das gerade die Zelle passiert. Das kann eine Luftblase sein, oder irgend welche Schlieren durch eine Druckwelle, die durch das Gerät…

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Symptome und Ursachen in der Routine-HPLC

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Änderungen im Chromatogramm einer Routine-Methode können bestimmten Ursachen zugeschrieben werden. Eine Zuordnung ist natürlich nicht immer einfach bzw. eindeutig. Die bewusste Wahrnehmung der Korrelation jedoch zwischen Symptom und Ursache hilft bei der Eingrenzung von mehreren, möglichen Ursachen. Beschränken wir uns hier auf die häufigsten Fälle, desweiteren setzen wir voraus, dass seitens des(r) Anwenders(in) keine Hardware- oder sonstige Änderung bewusst vorgenommen wurde, z. B. eine längere Säule oder eine längere/dünnere Kapillare eingebaut. Die Lösung In Tab. 1 sind auf der linken Spalte häufige Symptome und auf der rechten Seite mögliche Ursachen aufgeführt. Δ : Änderung F : Fluss tm…

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Ungewöhnliche Ursachen für Geisterpeaks/Spikes

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Der Fall Geisterpeaks bzw. Spikes sind eine häufige, ärgerliche Sache. Wir haben uns des Öfteren über dieses Problem unterhalten. Nun, man sollte in einem solchen Fall nicht nur an bekannte Quellen sondern – vor allem im Falle von unregelmäßig auftretenden Geisterpeaks – auch an ungewöhnliche Quellen denken, die mit der eigentlichen HPLC-Arbeit wenig zu tun haben. Was wären das? Die Lösung Nachfolgend werden kurz einige Ursachen für Geisterpeaks/Spikes genannt, an die man eher selten denken würde. Diese Beispiele basieren auf reale Fälle. Periodisch erscheinende Spikes, die Klima-Anlage und sonstige Geräte in der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Anlage können als Ursache ausgeschlossen…

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Schlussfolgerungen aus Veränderungen eines Chromatogramms im Routinebetrtieb

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Das Chromatogramm ist ein Bild – vielleicht nicht gerade mit tausend aber dennoch – mit vielen Worten. Aus manch einem Symptom/einer Veränderung des Chromatogramms im Routinebetrieb können einige Ursachen erkannt werden. Hier ist die Rede ist davon, dass der(die) Anwender(in) bewusst nichts geändert hat, d.h. keine Säule ausgewechselt, keinen neuen Eluenten angesetzt, die Anlage läuft über Nacht usw. Des weiteren unterhalten wir uns hier über einfache, isokratische RP-Trennungen. Welche typische Erscheinungen können nun helfen, um Ursachen schnell zu erkennen? Die Lösung In Tab. 1. haben wir in der linken Spalte 15 typische Situationen, also Veränderung eines oder mehrere…

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Erniedrigung der Nachweisgrenze durch Optimierung der Injektion

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Optimierung

Der Fall Die Verbesserung der Peakform ist in der Spurenanalytik (Reinheit, Stabilitäts- und Toxizitäts-Untersuchungen, Reinigungsvalidierung, Umweltanalytik) wichtiger als sonstwo. Denn wenn ich bei konstant injizierter Menge – und damit gleicher Fläche – einen scharfen und damit höheren Peak erhalte, ist die Quantifizierung mit einem kleineren Fehler behaftet. Es existieren einige bewährte Maßnahmen, die zu schmalen Peaks führen, z. B. dünnere Säulen, kleinere Teilchen, Erniedrigung des Totvolumens der Apparatur, Optimierung der Detektion, Verbesserung der Kinetik (Temperatur, Modifier) usw. Heute werden wir uns mit ein paar einfachen Tricks beim Injizieren beschäftigen. Die Lösung Es gibt zwei Ansätze: 1.) Verdünnung der Substanzzone verhindern…

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Nicht-endcappede Phasen – „ad acta“ legen?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuartiger C18-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappte sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell-, monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl ist? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als alte Technologie „ad acta“ legen? Die Lösung Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer…

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