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A FehlersucheACNApparaturAuto-SamplerDetektorGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsProbengeber

HPLC im Frühjahr… 

Der Fall Die HPLC-Analytik in Routinelabors findet heutzutage in den meisten Fällen unter weitestgehend gleichbleibenden Bedingungen statt: Qualifizierte Geräte, standardisierte Abläufe, klimatisierte Räume, feststehende Methoden usw. Dennoch muss man evtl. mit unreproduzierbaren Ergebnissen/Problemen rechnen, die saisonal bedingt sind. Neben bekannten Ursachen wie starke Temperaturunterschiede im Winter/Sommer bzw. Unterschiede in der Feuchtigkeit (Klassiker: Kondenswasser im Autosampler) gibt es diffizilere Ursachen. Lassen Sie uns hier den Focus auf einige Probleme richten, die im Frühjahr häufiger auftreten. Welche wären das? Die Lösung Nachfolgend beschriebene mögliche Ursachen kommen sicherlich nicht sehr häufig infrage; ich würde allerdings bei auftretenden Problemen auch an solche oder ähnliche...
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sk
2. April 2019
ApparaturB OptimierungBodenzahlEinstellparameterGradientHPLC-TippsInjektionsvolumenOptimierungProbenlösungsmittelTotvolumen

Wie kann ich einen Peak „schöner“ machen?

Der Fall Ein oder mehrere Peaks ist/sind klein und breit. Wie kann ich schnell die Peakform verbessern? Das Thema haben wir in ähnlicher Form bereits behandelt. Die Frage wird jedoch von AnwenderInnen recht häufig gestellt, ich kann gerne noch einmal darauf eingehen. Die Lösung Nachfolgende Vorschläge zielen auf typische RP-Systeme: Schnelle Maßnahmen, Zeitbedarf bis ca. 15-20 min Probelösung mit Wasser und/oder mit Kochsalz/Puffer versetzen und – wenn erlaubt – mehr injizieren, ansonsten Injektionsvolumen konstant lassen Säule umdrehen – nicht bei UHPLC-Säulen und auch nicht beim Gradienten: Evtl. vorhandene Hohlräume am Säulenkopf, die eine Verschlechterung der Peakform bedeuten, befinden sich nun...
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sk
1. März 2019
AuflösungBodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsPeakverbreiterungpolare KomponentenSystemeignungstest (SST)Veränderung der Retentionszeit

Sind neben Systemeignungstests (SST) weitere Tests notwendig bzw. sinnvoll?

Der Fall Mithilfe von SSTs wird überprüft, ob diese Methode an diesem Gerät „hier und jetzt“ funktioniert. Ob also die Anforderungen an diese Methode erfüllt werden oder eben nicht. Als Forderung kann beispielsweise ein bestimmter Wert für die Auflösung eines kritischen Paars oder die Bestimmungsgrenze für eine Nebenkomponente gelten. Sind weitere Tests notwendig zumal ja die Zeit immer knapper wird? Die Lösung Sicherlich gibt es hier unterschiedliche Vorstellungen. Nachfolgend meine persönliche Meinung und davon ableitend ein Vorschlag: Ein gut designter SST beinhaltet die Information, die ich brauche. Passt er, so ist nichts mehr zu tun. Passt er nicht, so wären...
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sk
2. Oktober 2018
A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsUncategorized

Die Kleinen im Sommer – Ursachen für Geisterpeaks

Der Fall Geisterpeaks sind immer wieder ein Problem – leider. Obschon häufig behandelt, möchte ich erneut das Thema aufgreifen und weiter unten ein paar eher seltenere Ursachen für plötzlich auftauchende Peaks schildern. Welche wären das? Die Lösung Vorbemerkung: Bei auftretenden Problemen frage ich die KollegInnen generell als erstes: „Habt ihr irgendetwas geändert, gab es etwaige räumliche Änderungen/Ereignisse, die mit dem Auftauchen des Problems zeitlich zusammen fallen“? Und dann kommt als Antwort, oft viel zu schnell: „Nein“. Bevor dieses „nein“ kommt, überlegen Sie sich bitte, ob vielleicht doch HPLC-relevante Sachen geändert wurden bzw. etwas „aus-der-Reihe“ passiert ist oder einfach anders läuft....
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sk
6. September 2018
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer…

Temperatur, Einstellparameter Im Sommer beschäftigen wir uns ja traditionsgemäß mit kleinen Tipps. Als erstes, passend zur Jahreszeit, ein paar Bemerkungen zur Temperatur. Alsdann folgen zwei Beispiele die zeigen, dass bei Unkenntnis der Einstellparameter einer übernommenen Methode und Verwendung von anderen Zahlenwerten man evtl. keine übereinstimmenden Ergebnisse erhält. Das kann viel Zeit und Nerven bei Methodentransfers kosten. Es lohnt sich daher, gegenüber solchen Dingen ein wenig Sensibilität zu entwickeln. Temperatur Wir gehen davon aus, dass zwei Säulenöfen technisch in Ordnung sind, sie wurden vor kurzem qualifiziert. Bei gleicher Temperaturanzeige kann es dennoch zu unterschiedlichen Chromatogrammen kommen wenn das Funktionsprinzip der zwei...
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sk
17. Juli 2018
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLC-MS-Kopplung

LC/MS-Kopplung – die Wartung der Drehschieberpumpe (Vorvakuumpumpe)

LC/MS-Kopplung – die Wartung der Drehschieberpumpe (Vorvakuumpumpe) Von Klaus Illig, Weil am Rhein Ölwechsel Ich schätze in den meisten Laboren wird das Öl der Vorvakuumpumpe einmal im Jahr gewechselt, auch wenn die Hersteller oft kürzere Intervalle vorschreiben. Wobei der Zeitraum sicherlich letztendlich nutzungsabhängig ist. Ein (sehr) erfahrener Kollege orientiert sich gar ausschließlich an der Verfärbung des Öls. Der unbeliebte Vorgang sieht üblicherweise wie folgt aus: 1) Massenspektrometer belüften und abschalten 2) Vorvakuumpumpe ausbauen indem diverse Anschlüsse gelöst werden 3) Die glitschige und schwere Pumpe auf eine erhöhte Position hieven um das Altöl abzulassen 4) Neues Öl nachfüllen, Pumpe wieder anschließen...
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ki
17. Juni 2018
A FehlersucheHPLC-TippsLC-MS-Kopplung

LC/MS-Kontaminationen – heute: Undefinierbarer „Schmodder“ im niedrigen m/z-Bereich

„Horch was kommt von draußen rein“ II LC/MS-Kontaminationen – heute: Undefinierbarer „Schmodder“ im niedrigen m/z-Bereich von Klaus Illig, Weil am Rhein Der Fall Irgendwann stört uns eine Verschmutzung im System. Sei es, dass das Rauschen im niedrigen m/z-Bereich (so zwischen 100 und 500) auf einmal zu hoch ist oder dass sehr fragile Analyte auf einmal einer erhöhten in-Source-Fragmentierung unterliegen. Ein besonderes Kontaminations-Signal liegt dabei nicht vor, oft ist es ein ganzer Rasen an undefinierbaren Signalen, die über die Zeit zu groß wurden. Seine üblichen Verdächtigen hat man bereits längst ausgeschlossen: Die HPLC-Anlage wurde schon zweimal ordentlich gespült und die Quelle...
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ki
17. Mai 2018
A FehlersucheHPLC-TippsLC-MS-Kopplung

LC/MS-Kontaminationen – heute: DMSO aus der Transfer-Kapillare

  „Horch, was kommt von draußen rein?“ I LC/MS-Kontaminationen – heute: DMSO aus der Transfer-Kapillare von Klaus Illig, Weil am Rhein Der Fall Die eigentlich gutmütige und ausgesprochene robuste HRAM-LC/MS-Kombination wurde mal etwas „dreckigeren“ Proben ausgesetzt, konkret biologische Matrix (von Ratten-Fäzes bis Menschen-Blut und Leber-Extrakten war alles dabei). Nachdem die Messungen der Studie abgeschlossen waren, wurde der Einlassbereich des MS vorsorglich sorgfältig gereinigt. Erste Tests mit der üblichen Kalibrierlösung zeigten keine Auffälligkeiten und das Gerät wurde für die weitere Nutzung als tauglich eingestuft. Bei der nächsten Studie mit einer höheren Flussrate, zeigte sich aber ein sehr deutliches Hintergrundsignal mit m/z...
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ki
17. April 2018
B OptimierungEinstellparameterHPLC-Tippskleine Peaks

Sehr kleine Peaks – was kann ich tun?

Der Fall Nehmen wir an, Sie müssen Komponenten in einer extrem geringen Konzentration quantifizieren – die Peaks sind einfach sehr klein. Es geht also im vorliegenden Fall vordergründlich nicht um eine gute Auflösung, es geht um eine gute Detektierbarkeit. Leider stehen Ihnen weder ein FLD noch eine LC/MS zur Verfügung, Sie müssen mit einem DAD arbeiten. Nehmen wir ferner an, es handelt sich um eine Gradientenmethode. Welche Möglichkeiten gibt es nun, einigermaßen auswertbare Peaks zu erhalten? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig einige Lösungswege: Kleines Säulenvolumen: Möglichst kurze und dünne Säulen, z. B. 30-50 x 2,1 mm Möglichst schwache Probelösung, die Peakform...
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sk
17. März 2018
EinstellparameterHPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Januar: „Denksport“ – die Lösungen

Liebe Leserinnen, liebe Leser, im Dezember habe ich Ihnen etwas HPLC-Denksport angeboten… Heute wollen wir uns anschauen, was nun die richtige Lösung ist. Von welchem Parameter/Charakteristikum eines DAD´s wird die Empfindlichkeit  nicht beeinflusst? Bandbreite („Bandwidth“) Spalt („Slit“) Datenrateaufnahme („Sample Rate“) Wellenlänge Rauschen Sie wird von allen beeinflusst; als Beispiel wird in Abb. 1 gezeigt, dass bei einer Bandwidth von 1,2 nm das Rauschen der Basislinie stärker ist als bei 12 nm. Somit ändert sich das Peak/Rauschen-Verhältnis und folglich auch die Empfindlichkeit. In Abb. 2 sieht man, dass bei einem Spalt von 16 nm mehr Licht auf die Moleküle in der...
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16. Januar 2018
HPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Dezember: „Denksport“ – die Fragen

Liebe Leserinnen, liebe Leser, lassen Sie uns das Jahr mit etwas HPLC-Denksport ausklingen… Die richtigen Antworten finden Sie hier. Bezüglich Antworten kann/können eine, keine, alle oder ein Teil davon richtig sein. Ich wünsche Ihnen viel Spaß und gutes Gelingen. Von welchem Parameter/Charakteristikum eines DAD´s wird die Empfindlichkeit  nicht beeinflusst? Bandbreite („Bandwidth“) Spalt („Slit“) Datenrateaufnahme („Sample Rate“) Wellenlänge Rauschen Was wird vom Totvolumen nicht/minimal beeinflusst, was jedoch bzgl. Verweilvolumens („Delay“-„Dwellvolume“) schon der Fall sein kann? Peakform Auflösung Elutionsreihenfolge Selektivität Retentionszeit Welcher chromatographischer Parameter ist bei der Gradientelution in der Regel von untergeordneter Bedeutung? Gradientenvolumen Bodenzahl (Effizienz, Trennleistung, Trennschärfe) Säulenlänge Totvolumen Verweilvolumen...
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sk
16. Dezember 2017
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseDetektorHPLC-TippsLC-MS-Kopplung

Welchen Detektor soll ich verwenden?

Der Fall Die Frage ist trivial und schwer zugleich. Doch bevor wir in die Problematik einsteigen, eine Bemerkung zu Beginn: Die gestellte Frage ist nur dann wirklich relevant, wenn erstens die Probe ziemlich unbekannt ist und zweitens ein begründetes Interesse an der „Wahrheit“ besteht. Damit ist gemeint, dass nicht folgendes im Vordergrund steht: Das Ergebnis möge so sein wie ich – und evtl. auch andere – es erwarte(n) und mir auch wünsche. Auch wenn es hart klingen mag wissen wir alle, dass im Alltag diese Situation gar nicht so selten vorkommt: Wir finden das, was wir suchen. Selten sind (Zeit)Ressourcen...
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sk
16. November 2017
A FehlersucheHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVariationskoeffizient (Vk)

Warum kann manchmal eine „zu gute“ Präzision beim Methodentransfer hinderlich sein?

Von Mike Hillebrand, Aventis Der Fall Ein Baustein des Methodentransfers ist die „Intermediate Precision“ (Laborpräzision). Dabei werden in beiden Laboratorien, dem aufnehmenden und dem abgebenden, Vergleichsanalysen mit der validierten, zu transferierenden Methode durchgeführt. Diese sollen sicherstellen, dass das empfangende Laboratorium in der Lage ist, die neue implementierte Methode anzuwenden. Dadurch ist eine vollständige Validierung der Methode im empfangenden Laboratorium nicht nötig. Das Design der „Intermediate Precision“ richtet sich nach dem Analyseverfahren, welches es zu transferieren gilt. Beispielsweise wird für eine Gehaltsbestimmung häufig ein Design verwendet, bei dem zwei Mitarbeiter pro Labor zum Einsatz kommen. Ziel ist das Prüfen einer Charge....
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mh
16. Oktober 2017
A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-Tipps

Geisterpeaks durch Rückstände in der Mischkammer

Von Werner Röpke, Braunschweig Der Fall In einer von mehreren Benutzern abwechselnd gefahrenen HPLC-Gradientenanlage treten immer wieder unerklärliche Störungen im Chromatogramm auf, die auch durch intensives Spülen nicht zu beseitigen sind. Die Störungen halten sich hartnäckig, auch bei mehrfachem Durchlauf von Leergradienten ohne Säule. Probleme mit dem Injektionsventil können insoweit ausgeschlossen werden, als dass das Ventil nicht betätigt wird und die Störungen trotzdem auftreten. Die Lösung Die wenigsten Laboratorien sind in der Lage, für eine bestimmte HPLC-Analytik eine einzige Anlage vorzuhalten. Ein Laufmittelwechsel, auch mit sorgfältigstem Spülen unter Verwendung intermediärer Phasen, hinterlässt immer Spuren. Isokratische HPLC-Systeme sind etwas unempfindlicher, denn...
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wr
16. September 2017
A FehlersucheHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVerweilvolumen

Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden III

Im zweiten Teil der kleinen Tipps-Serie zum Methodentransfer von HPLC-Methoden hat Mike Hillebrand auf fehlende Infos beim Methodentransfer hingewiesen. Fehlende Infos dürften in der Tat eine der häufigsten Ursachen für missglückte Methodentransfers sein. Im dritten und letzten Tipp zu diesem Thema greife ich daher diese Problematik erneut auf, dabei beschränke ich mich auf zwei Felder Themen: Beispielhaft werden weiter relevante Informationen bzgl. Hardware sowie „Probe auflösen“ genannt, die leider nicht immer weitergegeben werden. Diese Liste ist natürlich beliebig erweiterbar. Wichtige Infos, die die HPLC-Anlage betreffen – gleiche Anlage, anderes Ergebnis Man verwendet eine baugleiche Gradientenanlage und geht folglich davon aus, dass...
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mh
16. Juli 2017
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodentransfer

Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden II

Von Mike Hilebrand, Aventis „Fallstricke im HPLC-Methodentransfer – Verwendete Materialien und Equipment “ Fall 1: Beim Methodentransfer erhält das aufnehmende Labor durchweg niedrigere Gehaltswerte als das abgebende Labor. Es handelte sich um ein Produkt mit sehr niedriger Konzentration. Lösung zu Fall 1: Nach längerer Ursachenforschung wurde erkannt, dass das aufnehmende Labor einen anderen Vial-Typ verwendet als das abgebende Labor. Das abgebende Labor verwendet schon immer standardmäßig PP-Vials. Das aufnehmende Labor Vials aus Glas. Das Produkt weist in niedrigen Konzentrationen starke Adsorptionseffekte auf. Durch Verwendung von PP-Vials wurde die Adsorption verhindert. Da das Molekül negativ geladen ist, wird es durch die...
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mh
16. Juni 2017
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodentransfer

Analytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden I

Von Mike Hilebrand, Aventis Der Fall Nachdem wir als Analytiker eine analytische Methode entwickelt und validiert haben, ist es häufig der Fall, dass wir im Rahmen der Produktetablierung die Methode in andere Laboratorien transferieren müssen. Dies können sowohl interne als auch externe Laboratorien sein. Das Ziel dabei ist es, die Kollegen des aufnehmenden Labors in die Lage zu versetzen, die Methode so durchzuführen, dass dabei identische Ergebnisse wie im abgebenden Labor generiert werden. Man erspart sich damit eine Validierung der Methode im aufnehmenden Labor. Idealerweise sollte es ausreichen, die festgeschriebene Prüfanweisung an das aufnehmende Labor zu übergeben und zu schulen....
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mh
16. Mai 2017
A FehlersucheApparaturDetektorHPLC-Tipps

Ein paar Infos zum Inneren eines UV-Detektors

Der Fall Wir erleben seit längerem einen unaufhaltsamen Siegeszug der HPLC/MS-Kopplung. In Forschungsbereichen ist sie nicht mehr wegzudenken, die Vorteile liegen auf der Hand. In der Routine ist andererseits der UV-Detektor nach wie vor die Nummer 1 unter den Detektoren – obschon die LC/MS-Kopplung rasch aufholt. Wir wollen heute einen Blick in den UV-Detektor hinein werfen: An was sollte man beim Auftreten von Problemen denken? Die Lösung Die nachfolgenden Infos und Tipps richten sich vor allem an KollegInnen, die „Hand“ an das Gerät legen möchten/dürfen. Die erste Maßnahme: Im Falle von Drift und/oder Buckel in der Basislinie kann als erstes die...
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16. April 2017
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseDichtungenHPLC-TippsPumpe

Inbetriebnahme einer HPLC-Pumpe nach langer Stillstandzeit

von Werner Röpke, Braunschweig  Das Problem In Routinelabors steht die HPLC ja praktisch nie still, abgesehen von Wochenenden, und selbst dann lässt der Anwender sie meistens mit ganz kleinem Fluss durchlaufen, damit sie am Montagmorgen sofort betriebsbereit ist. In einem Labor an einer Universität kann es aber durchaus vorkommen, dass eine komplette Anlage ein oder zwei Semester außer Betrieb ist, weil gerade kein Projekt für die HPLC-Analytik ansteht. Wenn dann der neue Doktorand kommt und mit seiner Arbeit beginnen will, geht erfahrungsgemäß erst mal gar nichts. Im ungünstigsten Fall hat der letzte Anwender einfach alles abgeschaltet und die Anlage nicht...
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sk
16. März 2017
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsIntegration

Wie „richtig“ integriert meine Software?

Der Fall Wenn zwei oder mehr Peaks nicht Basislinie getrennt sind, ist die Integration mit Fehlern behaftet. Bei der Ermittlung der Peakfläche im Falle von gleich großen, symmetrischen Peaks und einem Valley zwischen den Peaks von kleiner 50 % der Peakhöhe beträgt der Fehler ca. 1-2 %. Dies dürfte kein ernstes Problem darstellen. Der Fehler bei tailenden, unterschiedlich großen und insbesondere sehr kleinen, sich an einer Drift befindenden Peaks kann allerdings in der Größenordnung von 50-60 % liegen (1). Man ist logischerweise unsicher und fragt sich, was denn das kleinere Übel ist: Lot fällen, Valley-to-Valley integrieren oder doch Tangential Skim anwenden?...
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16. Januar 2017