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Was ist eine Kopplung?
Streng genommen, handelt es sich dabei meist um die Online-Verbindung zweier Verfahren miteinander.
Beispielsweise erfolgt zunächst in einer HPLC-Anlage eine mehr oder weniger grobe Trennung eines komplexen Stoffgemisches; das gesamte Eluat oder bestimmte Fraktionen werden anschließend Online, d. h. direkt über ein Interface, in einen Gaschromatographen geführt. Dort wird das vorgetrennte Gemisch weiter in seine Bestandteile aufgetrennt. Oft schließt sich eine Identifizierung mittels Spektroskopie an, also: LC-GC/MS-Kopplung. Vereinfacht formuliert: Die HPLC fungiert in diesem Fall quasi als „Online-Probenvorbereitung“ für die Kapillar-GC/MS, siehe Abb. 1 und 2.
Im täglichen Sprachgebrauch hat sich allerdings eingebürgert, als Kopplung im Wesentlichen die Kombination „Chromatographie-Trennung“ und „Detektion mit spektroskopischer Information“ zu bezeichnen, z. B. LC- oder HPTLC/MS-Kopplung. Die Kopplung zweier chromatographischer Verfahren dagegen wird meist als „Zweidimensionale Chromatographie“ („2D“) bezeichnet.
Bedeutung und Vorteile der Kopplungsverfahren
Bedeutung
Die Bedeutung der Kopplungsverfahren wächst seit Mitte der 1980er Jahre permanent, das Thema nimmt einen breiten Raum in internationalen Symposien über Chromatographie ein. In diesem Zusammenhang werden folgende Begriffe benutzt: Hyphenated Techniques, orthogonale Analysentechniken, (Comprehensive) 2D, mehrdimensionale Chromatographie, selten: Chromatoskopie, Spektrographie. Die Kopplungsverfahren werden auch in den nächsten Jahren ein dominantes Thema in der Analytik bleiben. So läuft beispielsweise z. Z. ein EU-finanziertes Projekt zur 3D, das Ziel des Vorhabens lautet: Anfang der 2020er Jahre soll eine Peakkapazität von 1.000.000 (tatsächliche Trennung von ca. 125.000 Peaks) in einer Nacht erreicht werden.
Vorteile
1a) Kopplung zweier chromatographischer Verfahren miteinander
Bei komplexen Stoffgemischen wie Naturstoffgemischen, Emulgatoren, Pestizid-Metaboliten, Polymergemischen mit Monomeren usw. ist oft die Selektivität (genauer: die Peakkapazität, Anzahl der Peaks pro Zeiteinheit) eines chromatographischen Verfahrens nicht ausreichend, um alle Probebestandteile aufzutrennen. Durch die Online-Kopplung mit einem zweiten Verfahren, das nach einem möglichst unterschiedlichen Trennprinzip trennen soll, wird eine enorme Erhöhung der Trennkapazität erreicht. Z. B. mittels HPLC erfolgt eine (Vor-)Trennung nach Polaritäten und anschließend wird nach Molekülgröße mittels GPC getrennt. Durch die Kopplung multiplizieren sich im optimalen(!) Fall die Peakkapazitäten, z. B.
| HPLC: | Peakkapazität : 10 |
|---|---|
| Zweidimensionale DC: | Peakkapazität : 10 |
| Kopplung HPLC-Zweidimensionale DC: | Peakkapazität : 100 |
1b) Kopplung zweier unterschiedlicher Techniken miteinander, z. B.
- Gelelektrophorese – μ-HPLC/CLC
- Mikrodialyse – μ-HPLC/Kapillarelektrophorese
- HPLC – Immunoassay (Immunochromatographie)
Obwohl die Kopplung eines Trennverfahrens mit einem spezifischen Assay (z. B. HPLC gekoppelt mit einem enzymatischen Test) zu einer merklichen Verbesserung der Spezifität führen kann, widmet man sich heute eher der Kopplung zweier chromatographischer Verfahren.
2) Kopplung Chromatographie-Spektroskopie, bzw. Chromatographie – spezifische Detektion
Es sind viele Kombinationen denkbar. Nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über den heutigen Stand wieder (Auswahl).
Kopplungen chromatographischer Verfahren
Kopplungen chromatographischer Verfahren
| Was? | Kommentar |
|---|---|
| LC-LC | Im Moment mit Abstand die wichtigste Kopplungstechnik in diversen Varianten (z. B. RP-HILIC, RP-Mixed Mode, RP-RP usw.). Wird Hardware-und Softwaretechnisch von allen großen Hersteller unterstützt |
| SPE-LC | Neuer Name für eine alte Technik: Online-Kopplung eines Probenvorbereitungs- und eines Trennschrittes, z. B. Festphasenextraktion – HPLC-Trennung |
| LC-GC | Bereits seit Anfang der 1980er Jahre in der Diskussion und ansatzweise im Einsatz, noch kein Durchbruch (Gerstel, Axel Semrau) |
| LC-DC | Technisch und methodisch ausgereift, in der Umweltanalytik teilweise erfolgreich, noch nicht die Akzeptanz auf breiter Basis (Camag) |
| LC-CE/CEC | Technisch (mit Einschränkungen) ausgereift, kann in der Zukunft evtl. in miniaturisierter Form interessant werden |
| LC-GPC | Ausgereift, aussagekräftig, beschränkt sich auf ein relativ kleines Marktsegment in der Polymeranalytik (PSS) |
| SFE-SFC, SFE-GC | Keine Kopplung im eigentlichen Sinne, eher Automatisierung eines Probenvorbereitungsschrittes, sehr spezifisch, (noch) geringe Akzeptanz |
| SEC-IEC | Trennung von Proteinen zunächst durch Gelfiltration und anschließend mittels Ionenaustausch. Großes Potenzial, geringe Verbreitung |
Kopplungen Chromatographie-Spektroskopie
| GC-MS und GC-MS-MS | Die GC-MS-Kopplung war die erste Kopplung überhaupt, heute als Standardmethode anzusehen |
| SFC-MS | Technisch ähnelt sie stark der GC-MS-Kopplung, noch seltener Einsatz, wird stets interessanter |
| LC-MS und LC-Multi MS | Die wichtigste Kopplung der LC nach der Kopplung mit dem DAD, s. u.; ausgereift, mehrere Interfaces möglich, mittlerweile auch robust und günstig, immer mehr auf breiter Basis im Einsatz |
| LC-MALDI (Q-TOF) | Ausgereift, in der Analytik von (Bio-)Polymeren und im F & E-Bereich oft unverzichtbar |
| LC-UV(DAD) | Die erste Kopplung der LC mit der Spektroskopie, vielerorts die Standarddetektion, zwar angesehen aber nicht sehr aussagekräftig, da UV-Spektren nicht sonderlich spezifisch sind |
| GPC-FTIR | Seit über vierzig Jahren der Begleiter des forschenden Polymeranalytikers, sehr aussagekräftig |
| LC-FTIR | Erst seit Beginn der 1990er Jahre in der Diskussion; durch die Lösungsmittelbeschränkung relativ kleines Einsatzgebiet |
| LC-NMR | Enormer Informationsgewinn, Geräte sehr teuer und betreuungsintensiv, die Nachweisgrenze ist nach wie vor ein Problem, in Forschungsbereichen vereinzelt im Einsatz |
| LC-AAS, LC-ICP, ICP-MS | Durch lediglich eine Durchflusszelle ist ein jedes klassisches ICP- oder AAS-Gerät für die Online-Kopplung umrüstbar, hohe Nachweisgrenze, noch recht selten anzutreffen |
Von der weiteren Entwicklung der Mikro- und Sensorentechnik wird auch die Kopplungstechnik profitieren. Im Falle einer wachsenden Akzeptanz wird erwartet, dass die miniaturisierten und subminiaturisierten Kopplungssysteme, Mikro-Total-Analysen-Systeme, μTAS, Chip-HPLC-MS in der chemischen Prozesstechnik, der Qualitätskontrolle, der Medizin, der Vor-Ort-Umweltanalytik (als portable Systeme) und in der klinischen Diagnostik verstärkt eingesetzt werden – aber keines Falls auf breiter Basis in einem klassischen analytischen Labor.
Wann werden welche Kopplungen gebraucht?
1) Chromatographie 1 – Chromatographie 2 (2D)
Trennung komplexer Stoffgemische ähnlicher Komponenten, Erhöhung der Selektivität und der Peakkapazität (Hunderte bis Tausende von Peaks theoretisch trennbar) Außerdem: Die 2D-Chromatographie ist der beste „Detektor“, um die Peakhomogenität zu überprüfen. In Abbildung 3 wird gezeigt, dass unter Peak Nr. „D“ sich doch noch 18 Komponenten befinden – erst mit Hilfe der zweidimensionalen DC feststellbar. Und in Abbildung 4 befinden sich im vollkommen symmetrischen Peak Nr. 3 tatsächlich drei Komponenten – ebenfalls nur mit Hilfe der 2D erkennbar.
2) Chromatographie – Spektroskopie
Identifizierung unbekannter Probenkomponente, Erhöhung der Spezifität beigleichbleibender Auflösung
3) Chromatographie 1 – Chromatographie 2 – Spektroskopie Komplexe Trennung inkl.Identifizierung, Erhöhung sowohl der chromatographischen Auflösung/Peakkapazitätals auch der Spezifität
Applikationsbeispiele sind bei den Herstellern erhältlich, z. B. Camag für LC-DC, ThermoScientific, Agilent, Shimadzu, Waters für LC-LC, Bruker für LC-NMR, PSS für GPC- und LC-FTIR. Es ist verständlich, dass die Bereitschaft für Publikationen aus dem Industrieumfeld eher verhalten ist. Die gewonnenen Informationen sind meist für den eigenen Bedarf bestimmt, mancher Befund hat sich als äußerst brisant erwiesen. Ausführliche Beispiele über verschiedene Kopplungstechniken finden sich in folgenden Publikationen:
