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Gönne dir eine Pause …

Hier findest du zum Relaxen für zwischendurch …

triviales aber wichtiges …

 

Mit Hilfe von einfachen Formeln kann man bei einer geplanten Verkürzung der Säulenlänge die resultierende Gradientendauer oder im Falle von Methodentransfer (z. B. HPLC-UHPLC) die sich ergebenden chromatographischen Parameter errechnen. Eine große Hilfe stellen hier diverse Kalkulationsprogramme dar – solche Berechnungen erfolgen damit kostenfrei im Nu. Nachfolgend eine kleine Auswahl, schaue welche(s) dir am besten gefallen/gefällt:

Sicherlich bekannt, denke jedoch stets daran: Die ersten interessierenden Peaks sollten mindestens nach der 2-3-fachen Totzeit eluieren; ab hier sind die Wechselwirkungen stark genug. Bei Peaks, die früher eluieren, bleiben die Retentionszeiten selten konstant und die Peakform ist oft suboptimal

„Einmal ist keinmal“; Stimmt die Retentionszeit nicht oder sieht der Peak „komisch“ aus, injiziere noch einmal. Ein Problem sollte dich erst dann ernsthaft beschäftigen, wenn es wiederholbar ist. Nur einmal auftauchende Probleme würde ich einfach ignorieren (vielleicht eine einmalige Luftblase, mancher „Dreck“ eluiert gerade mit, der Chef war soeben in der Nähe des Detektors …)

Wenn das Chromatogramm oder ein Peak nicht so ist, wie es sein sollte… Investiere ca. eine Minute für ein schnelles Checken, ist die Ursache nicht sofort ersichtlich, musst du leider anschließend doch etwas mehr Zeit investieren:

„Die 60 s-Suche“
* Ist der Druck zu hoch/zu niedrig (Verstopfung/Luft)?
* Machen die Pumpe bzw. der Autosampler beim aufziehen komische Geräusche?
* Fällt dir am Gerät selbst oder in der unmittelbaren Umgebung etwas auf, z. B.
Vorratsgefäße voll, Ansaugfritte und Schläuche OK, nichts locker geworden, kein neues
Gerät in direkter Nachbarschaft zur HPLC usw.?
* Wirf einen Blick auf die Methodenparameter in deiner Methodentabelle: Kann es sein,
dass aus irgendeinem Grund doch ein Parameter anders gespeichert ist, z. B.
Mess-/Referenzwellenlänge, Peakwidth, Spaltbreite, Equilibrierzeit usw.

„Schwach“ sein ist manchmal recht effektiv – im positiven aber auch im negativen Sinne…

  • An schwachen Ionenaustauscher (WCX) werden sehr ähnliche ionische Komponenten häufig besser getrennt als an starken (SCX)
  • Mit einer schwachen Probelösung (im RP-Modus: jene einfach mit Wasser verdünnen) erreicht man häufig eine Verbesserung der Peakform und somit der Auflösung
  • Analog mit der mobilen Phase: Ein schwächerer Eluent (im RP-Modus: Wasser-/Puffer-reich) führt in der Regel zu einer besseren Trennung
  • Eine schwächere Isopropanol/Wasser-Lösung (z. B. 70/30 Iso-OH/Wasser) ist zum Entfernen von Mikroorganismen effektiver als beispielsweise eine starke, in etwa 90 oder 100 % Iso-OH-Lösung. So auch mit Wasserstoffperoxid: Eine 3 % ige H2O2-Lösung ist effektiver als z. B. eine 10 % -ige
  • Substanzen bleiben aus schwach-konzentrierten Probelösungen eher als aus stärker-konzentrierten durch Adhäsion oder Physisorption an allerlei Oberflächen „hängen“ (Memory-Effekt)

ungewöhnliches aber richtiges…

 

HPLC ist Wissenschaft (vielleicht…) und Magie zugleich. Einige Griffe erscheinen zwar etwas ungewöhnlich aber sie sind erfolgreich – sei mutig und probiere solche Sachen aus. Nachfolgend einige Beispiele:

  • TFA ist zwar OK, nur sie macht oft Probleme (Basislinie (!), manchmal Empfindlichkeitsverlust, Memoryeffekt…). Probiere einfach Pikrinsäure aus. Magst du sie nicht? Dann nimm´ doch vielleicht DFA (Difluoressigsäure)
  • Hast du Doppelpeaks und ein Umdrehen der Säule hat nichts gebracht? Stelle die Säule für 5-10 min ins Ultraschallbad. Bevor du sie sowieso entsorgst, kannst du es ja probieren…
  • Ein Ether im Bereich von 5-10 % in der mobilen Phase ist oft von Vorteil, vor allem bei stark apolaren Komponenten. Nur: In THF entstehen Peroxide (Geisterpeaks!) und PEEK-Kapillaren freuen sich – speziell bei höheren Temperaturen – definitiv nicht über THF. Alternative: Verwende Methyl-tert. Butylether (MTBE) – jedenfalls ein Versuch ist es wert
  • Heptan- oder Oktansulfonsäure (also B7 bzw. B8) sind zwei beliebte und hilfreiche Ionenpaarreagenzien – aber: Sie bereiten häufig Probleme wie z. B. zusätzliche Peaks, sie bleiben gerne überall hängen, die Säule ist irreversibel verändert, die Equilibrierung dauert eine „Ewigkeit“ und, und… Denke einfach an Methansulfonnsäure. Solltest du die gewünschte Selektivität/Peakform erreichen, bleibe bei ihr, du bekommst womöglich geringere Probleme

Hast du das Gefühl, dass die Oberfläche deines Materials nicht ganz „sauber“ ist? Injiziere 50-100 µl Dimethylformamid (DMF). Erhältst du keine Peaks, so sei froh, die Säule ist sauber, denn: DMF ist ein hervorragendes Lösungsmittel sowohl für polare als auch für apolare Komponenten, Verunreinigungen sind somit auf der Oberfläche deines Materials höchstwahrscheinlich nicht vorhanden. Kleiner Wermutstropfen: DMF ist nicht gerade gesund …

witziges aber wahres …

 

  • „Was sollte ich denn machen, die hatten nur Vodka …“

Folgende Anekdote eines Kollegen aus den Anfängen der HPLC: Er war um 1980 herum in der Sowjetunion auf Kundenreise. Im tiefsten Sibirien angekommen, wollte er nach einem Kundengespräch als Beleg für das Besprochene auch ein paar praktische Versuche durchführen – manch´ einer war logischerweise etwas misstrauisch gegenüber Versprechungen aus dem Westen … Damals war es mit dem Zoll noch viel schwieriger als heute, er konnte gerade zwei Säulen dabei haben, es waren je eine 25 cm lange Spherisorb C8 bzw. Spherisorb CN. Mit MeOH und ACN war natürlich „nichts“, aber Vodka, davon war reichlich vorhanden. Vodka bzw. Vodka verdünnt plus Spherisorb C8 oder Spherisorb CN bzw. Spherisorb C8 plus CN in Serie plus niedrige Temperaturen hätten zu fantastischen Trennungen von sehr ähnlichen, polaren Substanzen geführt. Und das ist absolut glaubhaft: Polarer, alkoholischer Eluent, recht polare stationäre Phase(n) und niedrige Temperaturen sind genau die richtigen Bedingungen für derartige Trennungen. Nun, die Retentionszeiten waren nicht gerade kurz, aber es war auszuhalten: Man nahm sich die Zeit um ausgiebig sich zu unterhalten, „Eluent“ war ja nicht gerade Mangelware…

  • Müßiggang hilft oft im Leben … oder: „The Beauty of Slowness“

Ein Labor beim deutschen Mutterkonzern hat viele Proben zu messen, die Geräte laufen quasi rund um die Uhr, die AnwenderInnen sind froh, dass sie das Probenaufkommen gerade noch bewältigen. Im Labor des  Tochterunternehmens in einem anderen Kontinent herrscht eine etwas andere Arbeitskultur: Jeden Freitag Nachmittag lässt man die Arbeitswoche mit ausgiebigem Plaudern bei Kaffee und Kuchen ausklingen. Während dieser Zeit werden allerdings die Geräte sehr lange, sehr gründlich mit heißem Wasser und Isopropanol gespült, diese Lösungsmittel (manchmal auch zusätzlich 0,01 N HNO3 und DMF) werden auch mehrmals injiziert. Im ersten Labor: „Buckel“ in der Basislinie, Geisterpeaks, Memory-Effekt. Im Zweiten, Null Probleme; Gerät, Autosampler und Säule werden ja regelmäßig gründlich gespült

  • „DL-Benzol“ – leider doch kein Nobelpreis …

Vor längerer Zeit hatte ich Enantiomere getrennt. Im Zuge der Experimente habe ich auch eine neue, selbst-entwickelte chirale Säule testen wollen. Sie sah vielversprechend aus: Von Aminosäuren über Thyroid-Hormone bis hin zu diversen Wirkstoffen konnte ich alle racemische Gemische in die die D- und L-Form trennen können: Ich bekam stets zwei Peaks, teilweise abhängig von der Retentionszeit sogar fast Basislinie-getrennt. Ich war unheimlich froh, aber das Ganze kam mir irgendwann ob dieses Glücks doch suspekt vor, also habe ich einfach Benzol injiziert. Ich bekam auch hier zwei Peaks. Dann wurde mir klar: Entweder habe ich mit „DL-Benzol“ die größte Entdeckung meines Lebens gemacht oder es stimmt etwas nicht. Leider war das zweite wahr: Ich habe die Säule umgedreht und ich erhielt bei den meisten Racematen – und natürlich auch mit Benzol – nur einen Peak: Am Säulenkopf war wohl ein „Loch“ im Packungsbeet – der Nobelpreis muss warten …

  • Man sollte doch diese gute Säule bestellen können …

Eine weitere Anekdote eines Kollegen: Einige Zeit nach einer Tagung erhielt ein bekannter Säulenanbieter eine wütende E-Mail eines Kunden, in etwa: Er habe vor kurzem eine Säule gekauft, aber sie war so schlecht, dass sie mehrere Peaks produzierte, während eine andere „gute“, gleichen Typs einen einzigen fantastischen Peak lieferte. Was war? Am Rande von Tagungen findet meist auch eine Ausstellung statt und besagter Besucher hatte eine Säule vom Stand des Säulenanbieters mitgehen lassen. Zu Hause hat er mit seiner Probe einen tollen Peak erhalten also hat er eine weitere Säule bestellt um diese Methode im Unternehmen zu etablieren, nur: Die Säule am Stand war eine leere …

„Sport“, Spaß, Gedanken, schmunzeln …

Mehr lesen

Wenn du möchtest, lehne dich zurück, trink´ deinen Kaffee oder Tee, mach´ vielleicht die Augen zu und lausche einfach ein paar Geschichten; wenn du lieber selbst liest, hier kannst du das auch.

Von kalten, dunklen Seen und von knisternden Begegnungen im HPLC-Land …

Die Wellen des Wandels

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4 Einträge
sk schrieb am 9. Juni 2021 um 14:13
öööööö
üüüüü
Administrator-Antwort von: sk
Admin Antwort
Hans-Joachim Kuss aus Putzbrunn schrieb am 14. Mai 2021 um 10:10
Ganz schön umfangreich
You aus Zwolle schrieb am 20. Februar 2020 um 14:53
Testeintrag; lösche ihn, wenn Du willst. ???
Administrator-Antwort:
Nur ein Test
S.Hantke aus Eschborn schrieb am 20. Februar 2020 um 14:32
Hallo dies ist eine Testanfrage
Administrator-Antwort von: omsag_dev
Hallo Herr Hantke, vielen Dank für Ihre Anfrage.
Gruß Admin