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HPLC Tipp des Monats

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Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Einstellparameter, Monatstipp, Nachweisgrenze

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“

Antwort:
Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist.
Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.

 

Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle:

  • Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom)
  • Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können dabei recht stark abweichen, siehe z. B. die Werte der zwei Spalten bei Empower und Chromeleon (Waters, Dionex/Thermo). Das betrifft nicht nur absolute Abweichungen, es können sich sogar sowohl Unter- als auch Überbefunde ergeben
  • Erst ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 ist bei allen kommerziellen CDS (Chromatography-Data-Systems) der Integrationsfehler merklich kleiner 1 %

Fazit bzgl. Richtigkeit – wenn das Ziel zuverlässige Ergebnisse lautet:
– Bei symmetrischen, BL-getrennten Peaks liegt der Fehler durch die Integration erst
ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 gesichert unter 1 %
– Bei tailenden, Nicht-BL-getrennten Peaks – evtl. noch auf einer driftenden Basislinie –
ist ein S/N-Verhältnis von ca. 100:1 empfehlenswert.

Auch die Reproduzierbarkeit der Integration bei mehrfacher Injektion (Präzision) lässt bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 oft zu wünschen übrig.

Empfehlung bzgl. Reproduzierbarkeit von Ergebnissen am LOQ:
Injizieren Sie sechs Mal eine reale Probe und ermitteln bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 den Variationskoeffizienten (VK, RSD, Relative Standard Deviation). Frage: Genügt der resultierende VK bei diesen chromatographischen Bedingungen an dieser Apparatur und bei diesen Settings Ihren Anforderungen? Wenn nicht, wäre das S/N-Verhältnis so lange zu erhöhen, bis dies der Fall ist. Diese Konzentration kann dann als gesichert reproduzierbares LOQ (Limit Of Quantification, Bestimmungsgrenze) angesehen werden, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wäre somit gegeben: Ihre Software kann bei dieser Konzentration reproduzierbar integrieren. Ein möglicher systematischer Fehler („Unrichtigkeit“ der Peakfläche und somit des Gehaltes) bleibt natürlich unerkannt, siehe dazu weiter oben „Richtigkeit“.
Merke:
Das in einigen regulierten Bereichen (FDA, ICH etc.) etablierte S/N-Verhältnis von 10:1 als Kriterium für LOQ basiert auf Richtlinien, es sind keine unverrückbare/gesetzliche Vorgaben: Es handelt sich ja um „Guidelines“ und nicht um „Regulation“/“Legal Requirements“. Es zeigt sich, dass mit Begründung ein größeres S/N-Verhältnis als Kriterium für LOQ von Auditoren/Inspektoren durchaus akzeptiert wird.

Weiterführende Infos und Angebote zum Thema „Validierung“: Artikel, Dokumente, Definitionen, Beratung, Bücher, Kurse

1. September 2025