Der Fall
Vorbemerkung: Die Rede ist hier von RP-Phasen und von kleinen Molekülen, Biomoleküle ist eine ganz andere „Story“ ebenso wie Ionenaustauscher und HILIC …
Als Faustregel gilt: 10-15 Säulenvolumina sollten reichen.
Das Säulenvolumen kann in erster Näherung mit folgender empirischer Formel berechnet werden:
Vs = tM x F/0,8 mit:
Vs: Säulenvolumen in ml
tM: Totzeit in min
F: Fluss in ml/min
Für eine 125 x 4 mm Säule beispielsweise (Fluss 1 ml/ min, Totzeit 1 min, Säulenvolumen ca. 1,25 ml), würden somit ca. 15-20 ml ausreichen.
Nun, wie „gut“ ist diese Faustregel?
Die Lösung
Weiter oben vorgestellte Faustregel ist gut anwendbar für MeOH/Wasser- und ACN/Wasser-Eluenten ohne Zusätze. Ferner für eher saubere Proben, also keine Umwelt- oder biologische Proben bzw. stark kontaminierten Proben.
Jetzt kommen wir zu den „schwierigeren“ Fällen, also zu Fällen, bei denen diese Faustregel ungenügend ist: Das notwendige Volumen zum Equilibrieren ist hier größer:
- Ältere Säulen, d.h. welche auf Basis von Kieselgel der ersten Generation (z. B. LiChrospher, Spherisorb, Bondapak, Supelcosil) sowie generell polare RP-Säulen wie Phenyl, Cyano oder Pentafluorphenyl, ferner Mixed-Mode-Phasen
- Stationäre Phasen mit größer spezifischer Oberfläche, z. B. 350 oder 400 m2/g. Solche haben i.d.R. kleine Porendurchmesser. Anders formuliert: Eine stationäre Phase mit 60 oder 80 Å-Poren benötigt eine längere Equilibrierzeit als eine mit einem Porendurchmesser von beispielsweise 300 Å.
- Der Eluent enthält über ca. 90% Wasser/Puffer, dadurch ergibt sich evtl. eine nur teilweise Benetzung der RP-Oberfläche
- Temperatur unter ca. 25 °C
- Die mobile Phase enthält über ca. 20 mMol Puffer oder/und Triethylamin oder/und Trifluoressigsäure bzw. Ionenpaarreagenzien, wobei Dodecylsulfonsäure natürlich „schlimmer“ ist als Methansulfonsäure
In solchen Fällen sollte das Volumen für das Equilibrieren ca. 30-50 Säulenvolumina betragen. Für die hier beispielhaft angenommene 125 x 4 mm Säule wären es ca. 40-60 ml. Es versteht sich von selbst, dass ungünstige Kombinationen das notwendige Volumen erhöhen, z. B: Eine polare stationäre Phase mit einer großen spezifischen Oberfläche betrieben mit einem gepufferten Eluenten bei niedriger Temperatur … Hier oder bei problematischen Matrices (Gewebe, Creme, Pflanzenextrakt, Polymere, Dextrane usw.) sollte das Volumen auf 80-100 ml erhöht werden, z. B. 2 ml/min, 45 min bei 30-35 °C.
Einfacher Test, ob das Equilibrieren erfolgreich gewesen ist: Säule umdrehen und ca. 20-50 µl Equilibrierlösung bei niedriger Wellenlänge injizieren. Sehe ich einen (breiten) Peak bzw. ein „Gebirge“ in der Basislinie? Wenn nicht, ist alles in Ordnung.
Das Fazit
Die notwendige Equilibrierzeit ist abhängig von den chromatographischen Bedingungen, der Natur der stationären Phase sowie der Matrix. Die weiter oben angegebenen Faustregeln haben sich als brauchbar erwiesen.
© Dr. Stavros Kromidas
