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Spülen der Säule Archive - Dr. Stavros Kromidas

Wahre HPLC-Geschichten zum Schmunzeln: Müßiggang, Wundersäule, „DL-Benzol“

Von Doppelpeaks, kleine Peaks, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Lassen Sie uns das neue Jahr etwas entspannt und locker angehen; der erste HPLC-Tipp des Jahres 2025 beschreibt drei, sagen wir, „spezielle“ Situationen aus dem echten HPLC-Leben. „The Beauty of Slowness“ Ein Labor beim deutschen Mutterkonzern hat viele Proben zu messen, die‘ Geräte laufen rund um die Uhr, die Anwenderinnen sind froh, dass sie das Probenaufkommen gerade noch bewältigen. Im Labor eines Tochterunternehmens in einem anderen Kontinent, welches die gleiche HPLC- Methode anwendet, herrscht eine etwas andere Arbeitskultur: Jeden Freitagnachmittag lässt man die Arbeitswoche mit ausgiebigem Plaudern bei Kaffee und Kuchen ausklingen, die restlichen Proben können ja ruhig am Montag fertig gemessen werden… Während der geselligen Zeit allwöchentlich freitags werden allerdings die Geräte immer sehr lange, sehr gründlich mit heißem Wasser und Isopropanol gespült, diese Lösungsmittel (manchmal auch zusätzlich 0,01 N HNO3 und DMF) werden auch mehrmals injiziert. Im ersten Labor: „Buckel“ in der Basislinie, Geisterpeaks, Memory-Effekt. Im Zweiten: Null Probleme; Gerät, Autosampler und Säule werden ja regelmäßig gründlichst gespült, allerlei Verunreinigungen verlassen zwangsläufig das Gerät – gemütliche Zeit während der etwas Vernünftiges passiert, ist eine doppelt gewinnbringende Zeit. Merke: Im Falle einer schwierigen Matrix (Salbe, Tween, Cellulose, Lipide usw.) bleibt ein gründliches Spülen der Anlage inkl. Säule mit Lösungsmitteln…

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Wie lang soll ich eine HPLC-Säule equilibrieren?

Von Allgemein, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Säule, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Vorbemerkung: Die Rede ist hier von RP-Phasen und von kleinen Molekülen, Biomoleküle ist eine ganz andere „Story“ ebenso wie Ionenaustauscher und HILIC … Als Faustregel gilt: 10-15 Säulenvolumina sollten reichen. Das Säulenvolumen kann in erster Näherung mit folgender empirischer Formel berechnet werden: Vs = tM x F/0,8 mit: Vs: Säulenvolumen in ml tM: Totzeit in min F:  Fluss in ml/min Für eine 125 x 4 mm Säule beispielsweise (Fluss 1 ml/ min, Totzeit 1 min, Säulenvolumen ca. 1,25 ml), würden somit ca. 15-20 ml ausreichen. Nun, wie „gut“ ist diese Faustregel? Die Lösung Weiter oben vorgestellte Faustregel ist gut anwendbar für MeOH/Wasser- und ACN/Wasser-Eluenten ohne Zusätze. Ferner für eher saubere Proben, also keine Umwelt- oder biologische Proben bzw. stark kontaminierten Proben. Jetzt kommen wir zu den „schwierigeren“ Fällen, also zu Fällen, bei denen diese Faustregel ungenügend ist: Das notwendige Volumen zum Equilibrieren ist hier größer: Ältere Säulen, d.h. welche auf Basis von Kieselgel der ersten Generation (z. B. LiChrospher, Spherisorb, Bondapak, Supelcosil) sowie generell polare RP-Säulen wie Phenyl, Cyano oder Pentafluorphenyl, ferner Mixed-Mode-Phasen Stationäre Phasen mit größer spezifischer Oberfläche, z. B. 350 oder 400 m2/g. Solche haben i.d.R. kleine Porendurchmesser. Anders formuliert: Eine stationäre Phase mit 60 oder 80 Å-Poren…

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Spülen einer HPLC-Anlage

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Spülen ist sicherlich eine der besten präventiven und kurativen Maßnahmen in der HPLC. Während für die meisten Anwender der Spülschritt bei einer Gradientenelution am Ende des Laufs einfach dazugehört, erfolgt bei isokratischen Trennungen ein solcher in der Regel erst bei Bedarf, was aus ökonomischen Gesichtspunkten auch richtig ist. Schauen wir uns doch an, an welchen Symptomen dieser „Bedarf“ erkannt wird, was die Ursachen sind und wie gespült werden sollte. Bemerkung: Einige der unten aufgeführten Symptome (z. B. Tailing, Änderung der Retentionszeit) können natürlich auch andere Ursachen haben. Die Lösung Tab. 1: Spülen einer HPLC-Anlage Das Fazit Mit sauberem…

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Wie entferne ich organische Verunreinigungen schnell von einer RP-Phase?

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Stark organische Substanzen (Lipide, große Moleküle etc.) können an RP-Phasen, insbesondere C18, regelrecht ,,kleben“ bleiben. Das Ergebnis ist manchmal ein hoher Rückdruck und fast immer eine Verschlechterung der Trennung. Es kann zu der Bildung von breiten und tailenden Peaks oder auch Geisterpeaks kommen. Man müsste also mit MeOH oder ACN spülen. Das bedarf aber eines gewissen Aufwands und die Zeit ist oft knapp. Was tun? Die Lösung Injizieren Sie 100 μl oder 200 μl MeOH oder ACN. (Überprüfen Sie vorher, ob durch die ACN-Injektion in pufferhaltigen Eluenten kein Niederschlag entsteht!). Sollten sich organische Substanzen an der RP-Oberfläche befinden,…

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