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Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Das Nonplusultra zur Überprüfung der Peakhomogenität: Multidetektion und 2D-Chromatographie

Von 14. Juli 2025 August 7th, 2025 No Comments

Zusammenfassung

Multidetektion und insbesondere 2D-Chromatographie sind die besten Tools, um Peakhomogenitäten zu überprüfen bzw. mittels letzterer die Auflösung zu verbessern. Der Aufwand jedoch bei der Etablierung einer 2D-HPLC sollte nicht unterschätzt werden. Ferner sind zwei Nachteile bei 2D-Anwendungen zu nennen: Mangelnde Robustheit und Verlust an Empfindlichkeit.

Der Fall

Beim letzten HPLC-Tipp haben wir uns den orthogonalen Test angeschaut: Eine gänzlich andere Säule und/oder ein gänzlich anderer Eluent sind sehr hilfreich, um die Peakhomogenität (Peakreinheit) zu überprüfen. Heute geht es um die in diesem Zusammenhang vermutlich zwei besten Tools:
Stufe 1, recht einfach: Einsatz eines zweiten/dritten Detektors; Multidetektion ist mittlerweile in vielen Laboren eine Selbstverständlichkeit
Stufe 2, recht aufwendig: „2D“ (2-dimensionale Chromatographie) anwenden; 3D gibt es zwar auch schon seit jeher – aber lassen wir es hier lieber …
Was hat denn beides auf sich?

Die Lösung

  1. Multidetektion

Ein zweiter/dritter Detektor in Serie kann erstens Peaks detektieren, die bei Verwendung nur eines Detektors unsichtbar bleiben und zweitens Peaks, die schlecht abgetrennt sind, wenigstens als solche erkennen.
In Abb. 1 wird die Verunreinigung bei 6,72 min nur mit MS (ESI-Positiv), jedoch nicht mit DAD erkannt (oberes Bild). Im ESI-Negativ-Modus (unteres Bild) ist zwar das Signal bei 6,72 min wesentlich größer, dafür fehlt jedoch der Peak bei 2,33 min.

Abbildung 1
Durch zwei Detektoren in Serie können mehr Peaks erkannt werden, Details, siehe Text

Fazit 1: DAD-MS/MS mit allen seinen Facetten (mehrere Spektren, zwei Interfaces, zwei Übergänge etc.) ist ein sehr guter Ansatz und seit längerem Stand der Technik

Allerdings: Nicht alle Komponenten sind UV-aktiv und nicht Alle können ionisiert werden. Ein Universal-Detektor wie CAD, der „alles“ sieht oder ein spezifischer und empfindlicher Detektor wie FLD stellen hier sehr gute Ergänzungen dar.
In Abb. 2 wird ein Chromatogramm mit CAD, DAD und MS gezeigt. Mit CAD werden zunächst „alle“ Peaks angezeigt. Die Verunreinigung bei ca. 1,7 min allerdings wird beim UV-Detektor kaum, beim universalen aber unempfindlichen Aerosoldetektor CAD nicht erkannt. Dies ist nur mithilfe der MS-Kopplung der Fall (mittleres Chromatogramm).

Abbildung 2
Die Verwendung mehrerer Detektoren erweitert die Detektierbarkeit chemisch unterschiedlicher Komponenten, Details, siehe Text

Fazit 2: Neben der Kopplung DAD-MS/MS wäre je nach Fragestellung ein weiterer, Universal- oder ein spezifischer/empfindlicher Detektor eine gute Ergänzung, auch dies ist bereits Stand der Technik  

  1. 2D-Chromatographie

Das 2D-Prinzip, stark vereinfacht: Nach der Trennung an einer Säule (erste Dimension, Trennmechanismus A) wird/werden ein Peak/alle Peaks zu einer zweiten möglichst orthogonalen Säule (zweite Dimension, Trennmechanismus B) überführt und dort weiter aufgetrennt.
Die häufigsten Kombinationen sind: HILIC-RP, RP-RP, SEC-IEX, LC-SFC.
Die anschließend üblichen Detektionsmodi sind: MS/MS, IM-MS, ICP-MS.
2D ist nicht neu; Abb. 3 zeigt die 2D-Trennung von Chlorphenolen aus den 1990er Jahren, die zwei orthogonalen Säulen waren Kieselgel und C18.

Abbildung 3
Koeluierende Komponenten unter einem Peak können mittels zweier unterschiedlicher Säulen im 2D-Modus aufgetrennt werden

Abb. 4 zeigt eine 2D-Trennung aus den 1980er Jahren, die Kopplung hier war HPLC-DC (Dünnschicht-Chromatographie): Unter dem letzten HPLC-Peak „D“ befinden sich 18 (!) Komponenten, die mittels DC erkannt werden. Je unterschiedlicher die Trenn-Mechanismen sind, umso größer ist die Anzahl der theoretisch trennbaren Komponenten (Multiplikation der Peakkapazitäten der zwei Trennmodi).

 

Abbildung 4
Unter einem HPLC-Peak können sich mehrere Komponenten verbergen, Details, siehe Text

Natürlich werden viele Leser:innen jetzt denken, „So schlimme Chromatogramme haben wir bei uns erfreulicherweise nicht“, siehe jedoch dazu Abb. 5: Chromatogramm mit zunächst „nur“ 6 Peaks: Man erkennt zwar leicht durch den „Buckel“ beim vierten Peak, dass dieser nicht homogen ist (zwei Peaks, siehe LC x LC-Kopplung, rechts im Bild). Der dritte, völlig symmetrische Peak allerdings enthält drei Komponenten!
Merke: Peaksymmetrie ist verführerisch.

 

Abbildung 5
2D-Chromatographie erhöht stark die Wahrscheinlichkeit, Koelution auch im Falle von symmetrischen Peaks zu erkennen, Details, siehe Text

Fazit 3: 2D mit anschließender Multidetektion ist vermutlich die beste Möglichkeit, die Peakreinheit zu überprüfen, bzw. die Auflösung zu verbessern

Bemerkungen:

  • Seit Jahren bieten alle großen HPLC-Anbieter ausgereifte Hardware-Lösungen für 2D-Trennungen, deren Knowhow sollte gezielt genutzt werden
  • 2D kann nicht von „jetzt auf gleich“ etabliert werden, praktische Herausforderungen (z. B. „Mismatch“ Eluent 2. Dimension u.v.m.) sind nicht vernachlässigbar. Für 2D-Projekte sollten erfahrene Mitarbeiter:innen abgestellt werden, alternativ könnte an die Vergabe einer Bachelor-/Master-Arbeit gedacht werden. Arbeitskreise, die hier fundierte Erfahrungen haben sind: Prof. Michael Lämmerhofer, Tübingen, Prof. Oliver Schmitz, Duisburg-Essen
  • 2D ist hervorragend geeignet, um die Peakreinheit zu überprüfen bzw. die Auflösung zu verbessern. Folgendes sollte allerdings hier nicht vergessen werden: Mit Robustheit wird es „schwierig“ und die Empfindlichkeit nimmt ab.

Weitere Infos zum Thema:

© Dr. Stavros Kromidas

Restliche HPLC-Tipps des Jahres unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

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