Der Fall
Wie beim vorherigen HPLC-Tipp geht es auch heute um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Beim letzten Mal haben wir gesehen, dass eine Änderung der Einstellparameter („Settings“) durchaus hilfreich sein kann. Heute steht die Probelösung im Focus: Schnell durchzuführende „Manipulationen“ bzgl. Probelösung können ebenso helfen. Welche wären das?
Die Lösung
- Verdünne die Probelösung oder injiziere weniger
Wir alle überladen öfters als gedacht die „arme“ Säule. Ergebnis: Verschlechterung der Auflösung. Eine lokale Überladung der Säule macht sich vor allem am Anfang des Chromatogramms bemerkbar; dort eluieren in einem RP-System polare Komponenten, die zusätzliche polare Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase eingehen können („Dualer Mechanismus“). Die Devise lautet: Probelösung, also Diluent, einfach mit Wasser verdünnen oder vielleicht noch einfacher: Weniger injizieren. In Abbildung 1, rechts, wird die Injektion von 20 µl Acetophenon gezeigt: Der erste Peak ist eine Verunreinigung, der zweite die Hauptkomponente Acetophenon. Anschließend wurde lediglich Eluent injiziert, linkes Chromatogramm. D.h. hier wurde der Memory-Effekt ausgenutzt: Es befindet sich häufig ein kleiner Rest der Probe an der Nadel, der nicht immer 100% weggespült wird. Wie man leicht erkennt, ist die Verunreinigung sauber, Acetophenon dagegen nicht: Auch mit 20 µl kann eine Säule lokal überladen sein.
Erfahrene Anwenderinnen kennen nun das und es wird grundsätzlich wenig injiziert, z. B. 5 µl, siehe Abbildung 2. Betrachten wir den Peak bei 3,557 min. Wenn anschließend lediglich 1 µl injiziert wird, erkennt man leicht (siehe rechts das gezoomte Chromatogramm), dass der Peak nicht homogen ist. Sogar 5 µl – natürlich auch abhängig von der Konzentration – können zu viel sein. Ein weiterer Beleg für die Überladung bei der Injektion von 5 µl im vorliegenden Fall ist die kürzere Retentionszeit (3,557 min vs. 4,154 min), denn: Eine Überladung geht meist mit einer Abnahme der Retentionszeit einher. Überladung bedeutet ja, dass bestimmte aktive Zentren an der Oberfläche der stationären Phase belegt sind, die Moleküle finden keinen Platz für eine Wechselwirkung, sie eluieren folglich früher.
- Die Probelösung soll schwächer (in einem RP-System, sprich: Polarer) als der Eluent bzw. der Anfangsgradient sein; verändere auch den pH-Wert der Probelösung!
Betrachten wir in Abbildung 3 den Peak bei ca. 2,203 min, oben links: Bei der Zugabe von einem Neutralsalz (hier KCl) zu der Probelösung wird eine Peak-Aufsplittung beobachtet (unten links). Statt einem Neutralsalz kann auch der für den Eluenten verwendete Puffer benutzt werden (oben rechts), es erscheint ein weiterer Peak. Schließlich kann der pH-Wert der Probelösung verändert werden (unten rechts). Bei Unkenntnis des pKA/B-Wertes der betreffenden Komponente, einfach in ein vial mit der Probe einen „Tropfen“ Säure und in ein zweites einen „Tropfen“ Base dazu tun und jeweils nochmal injizieren.
In Abbildung 4 wird ein weiterer Fall gezeigt, wo lediglich durch eine Veränderung des pH-Wertes der Probelösung eine Verbesserung der Auflösung erreicht wurde.
- Verändere das Probelösemittel
In Abbildung 5 wird ein Chromatogramm gezeigt, einmal mit ACN und einmal mit MeOH als organischem Lösemittel zum Auflösen der Probe. Bei Peak Nr. 1 und 3 spielt die Natur des organischen Lösemittels keine Rolle. Peak Nr. 2 entpuppt sich jedoch als zwei Komponenten, wenn ACN verwendet wird. Auch als schneller Test zur Prüfung auf Peakhomogenität „zwischendurch“ geeignet: Ein „Tropfen“ Iso-OH oder THF zu der Probelösung dazu geben und nochmal injizieren. Bleibt die Anzahl der Peaks gleich?
Das Fazit
Verdünnen/weniger injizieren sowie „Manipulationen“ – im positiven Sinne! – der Probelösung stellen schnelle Tests zur Prüfung der Peakhomogenität dar. Und: Die Probelösung verändern geht schneller als den Eluenten verändern.
© Dr. Stavros Kromidas
Restliche HPLC-Tipps des Jahres unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/
