Im – jedenfalls kalendarischen …– Sommer wollen wir uns mit kleinen, knackigen Tipps beschäftigen. Heuer geht es um „die 80 %-Regel“, „Vorteile von Methanol“ und „Mach´ Probelösung und Eluent möglichst ähnlich“.
„80%-Regel“
Bei einer Routine-Methode steht i.d.R. Robustheit an erster Stelle, das heißt beispielsweise: Ich erwarte reproduzierbare Ergebnisse und die Säule soll möglichst lange halten. Es hat sich gezeigt, dass ein „Puffer“, also ein Abstand, von ca. 20 % von einem Grenzwert Sicherheit liefert. Nachfolgend einige Beispiele:
- Einige GPC/SEC-Säulen sind laut Datenblatt bis 100 bar stabil; das Nicht-Überschreiten von 80 bar im Dauerbetrieb beschert eine lange Lebensdauer
- Manch ‘ein Säulenofen ist von 5 – 80 °C spezifiziert; an beiden Grenzen – also ca. 6 °C sowie ca. 70 °C – ist eine richtige und präzise Temperatur-Einstellung nicht immer gewährleistet. Messungen in diesen Bereichen sind oft nicht reproduzierbar
- Bei einer Reihe von Säulen wird als pH-Wert-Verträglichkeit der Bereich 2 – 8 angegeben; im Dauerbetrieb würde ich allerdings bei derart spezifizierten stationären Phasen nicht unter ca. pH von 2,4 und nicht über ca. pH 6,5 gehen: Im Sauren können kleine funktionelle Gruppen hydrolysiert werden („Bluten“ der Säule) und ab ca. pH 7,0 kann sich das Kieselgel auflösen. Denke in diesem Zusammenhang auch an eine Verschiebung des pH-Wertes nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels
- Ein Dauerbetrieb von nicht über ca. 80 % vom „High Pressure Limit“ der Pumpe schont Dichtungen und Bewegteile
- Die Oberfläche von stark hydrophoben RP-Phasen (dichte Belegung der Oberfläche mit C18-Alkylketten) ist bei geringem Fluss und einer Temperatur um die 25 °C oder niedriger und bei mehr als 80 % Wasser/Puffer womöglich nicht benetzt. Man kann zwar problemlos die Säule mit z. B. 80 % Wasser spülen – aber messen? Konstante Retentionszeiten sind zwar möglich, aber na ja…
Schlussbemerkung: Ein „Puffer“ von 10 % ist oft ausreichend, aber wenn die Stabilität in der Routine im Vordergrund steht, wäre ich hier doch etwas vorsichtig.
Vorteile von Methanol gegenüber Acetonitril
Vorbemerkung: Der Focus liegt hier in seiner Rolle bzgl. der chromatographischen Trennung. Andere, unter Umständen sicherlich auch wichtige Aspekte, wie Preis und einfache(re) Herstellung und somit i.d.R. geringere Kontaminationen lassen wir hier außer Acht. Die drei wichtigsten Vorteile gegenüber Acetonitril sind:
- Die Peakform von Säuren ist besser
- Ähnliche und/oder polare Komponenten werden besser getrennt
- Die Unterschiede der stationären Phasen kommen eher zum Vorschein. Mit Acetonitril – vor allem im Zusammenhang mit Puffern – haben wir oft eine Art „Gleichmacherei“: Chromatogramme an unterschiedlichen Säulen sehen mit Acetonitril als organischem Lösungsmittel oft ähnlich aus
Probelösung und Eluent
Optimale Situation:
Die Probelösung ist mit dem Eluenten/dem Anfangsgradienten „identisch“ – nur etwas „schwächer“; schwächer im RP-Modus heißt, polarer. In einem solchen Fall ergibt sich eine gute Peakform, es sind auch keine Störpeaks in der Nähe der Totzeit festzustellen.
Recht gute Situation:
Probelösung und Eluent/Anfangsgradient sind „ziemlich“ ähnlich, z. B. der Eluent enthält Puffer, die Probelösung ist jedoch lediglich Wasser ohne Salz. Oder das organische Lösungsmittel ist in beiden Fällen identisch, allerdings in unterschiedlicher Konzentration.
Suboptimale Situation:
Probelösung und Eluent/Anfangsgradient sind nicht identisch; je größer die Unterschiede, umso größer die Probleme. Als Probleme sind zu nennen: Fronting/Doppelpeaks, evtl. Abnahme der Retentionszeit (Probelösung ist stärker im Vergleich zum Eluenten/Anfangsgradienten), Geisterpeaks/negative Peaks in der Nähe der Totzeit, evtl. Peakverbreiterung/Tailing (unterschiedlicher pH-Wert, Salz ja/nein, Modifier ja/nein usw.)
Empfehlung: Wenn Probelösung und Eluent nicht identisch sein können: Versuchen Sie wenigstens sie ähnlich zu machen: z. B. Probelösung 1:1 oder 1:2 mit dem Eluenten verdünnen und das doppelte/dreifache Volumen injizieren: Die Peakform wird besser.
© Dr. Stavros Kromidas
