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HPLC-Tipps

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Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 2

Von B Optimierung, HPLC-Tipps

Der Fall Die Peaks machen am Ende einer Trennungsoptimierung einen „ordentlichen“, symmetrischen Eindruck, auch die Auflösung zwischen den Peaks ist zufriedenstellend. Wie können Sie nun mit einem vertretbaren Aufwand überprüfen, ob alle vorhandenen Komponenten tatsächlich sichtbar sind? Die Lösung Es gibt zweifelsohne eine Reihe möglicher Wege: Von einer Änderung der chromatographischen Parameter (z.B. pH-Wert, Temperatur, stationäre Phase) bis hin zu Kopplungstechniken wie LC-MS. Je nach Umfeld, Wichtigkeit der Probe etc. mag die eine oder andere Massnahme richtig bzw. gerechtfertigt sein. Nachfolgend ein Vorschlag, der sich relativ leicht realisieren lässt: Sie wiederholen die Trennung bei einer möglichst unterschiedlichen Kombination Säule –…

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9. Februar 2003

Selektivität „nur“ durch unterschiedliche Wechselwirkungen?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Säulenauswahl

Der Fall Wir haben alle gelernt, dass – außer vielleicht bei der Ausschluss- und der Affinitätschromatographie – eine chromatographische Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen der zu trennenden Analyte mit der stationären Phase zustande kommt. Dabei werden je nach Mechanismus stark ionische bis stark hydrophobe Wechselwirkungen angenommen. Verteilungsmechanismen sind bei der HILIC ein Thema, sonst finden sie wenig Erwähnung. Sind aber lediglich Wechselwirkungen alles was die Selektivität beeinflusst? Die Lösung Nein. Auch für kleine Moleküle können sterische Aspekte von Bedeutung sein, siehe dazu Abb. 1. Bei der Trennung einer Mischung von Metaboliten von tricyclischen Antidepressiva, also durchaus kleine Moleküle, werden an zwei „polaren“…

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4. Januar 2003

Die Sicht der Dinge… Oder: Selektivität vs. Peaksymmetrie von basischen Komponenten an hydrophoben Phasen

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Säulenauswahl

Nach Durchsicht meiner Notizen habe ich mich für folgendes Beispiel entschieden: Der Fall Habt ihr vor, stark basische Substanzen zu trennen? So, so, dann aber Vorsicht: Nehmt dazu von mir aus eure geliebten, modernen, teueren, sauberen, Metallionen-armen, gut abgedeckten, super endcappten Phasen. In einer Hinsicht habt ihr Recht: Ihr bekommt sicherlich schöne, symmetrische, schlanke Peaks –eine „scharfe“ Trennung eben, siehe Abb. 1. Abb.1 „Trennung“ von Pyridin/Benzylamin, Uracil (inert!), Phenol in einem sauren Phosphatpuffer an einer hydrophoben RP-Phase Seht ihr aber auch alles? Merke: Mit polaren/ionischen Komponenten und hydrophoben Phasen ist Umsicht eine unabdingbare Tugend. Die Lösung Tut mir und euch…

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5. Dezember 2002

Geisterpeaks beim Blindgradienten

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Es ist Usus vor einem Gradienten-Lauf einen „Blindgradienten“ zu fahren. Sollte nun bei diesem Testlauf die Drift auffallend stark sein oder gar Geisterpeaks erscheinen, besteht Handlungsbedarf, denn: Wir haben hier wahrscheinlich mit Kontaminationen zu tun. Wie könnte man jetzt den Herkunftsort der Kontamination ausfindig machen? Die Lösung Man verlängere die Equilibrierzeit vor der nächsten Injektion. Wird ein vorher festgestellter Geisterpeak größer oder nimmt die Drift zu, so liegt das Problem in der wässrigen/wasserreichen Phase. Knüpfen Sie sich die Reinheit des Wassers und eventuellen Zusätzen vor: Wasser mit UV-Licht bestrahlen falls Algen im Spiel sind, Patrone(n) aus der Milli-Q-Anlage…

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9. November 2002

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben…

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8. Oktober 2002

Die „Kleinen“ im Sommer

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Uncategorized

Ionenpaarreagenzien Trennung von starken Basen Früh eluierende Peaks und Peakform Drift beim Gradienten Überprüfung der Peakhomogenität 100 % Wasser In Wasser instabile Komponenten   Als beliebte Ionenpaarreagenzien gelten verdienterweise Hexan- und Heptansulfonsäure. Sollte jedoch irgend eine Ihrer Basen Ihnen zu früh kommen, denken Sie vielleicht alternativ auch an Campfersulfonsäure: Ihr Peak kommt später und Sie könnten evtl. besser trennen. Möchten Sie recht starke Basen wie β-Blocker oder organische Basen wie Tricyclische Antidepressiva trennen, aber Sie haben nur alte, „normale“ Säulen im Schrank? Nehmen Sie Ihre „0815“ Säule und verwenden als Eluent wie folgt: 100-200 mMol Natriumdodecylsulfat mit ca. 15% 1-Propanol…

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9. September 2002

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Säulenlagerung Geisterpeaks Saurer pH-Wert Änderung der Probelösung   Polare RP-Phasen, ob nicht-endcappte C18 oder polare „embedded phases“ oder welche mit kurzen Alkylketten usw. sollten Sie für längere Zeit, z. B. mehrere Monate, lieber in Mischungen des aprotischen Acetonitrils (ca. 70-80% ACN) und nicht des recht polaren Methanols lagern. Es besteht nämlich bei letzterem die Gefahr von Hydrolyse-Vorgängen, die Phasenoberfläche kann sich chemisch verändern Geisterpeaks zum Ersten: Sagen wir, Sie bekommen ungebetene, zusätzliche Peaks in Ihrem Chromatogramm, oder der Peak einer Komponente bekommt einen „Buckel“ usw. Sicherlich gibt es mehrere mögliche Ursachen dafür. Denken Sie bei Ihren Recherchen auch an die…

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9. August 2002

Die „Kleinen“ im Sommer

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized

Degasser Ultraschallbad pH-Wert-Verschiebung „sehr“ sauberes Wasser… Spülen Polymere durch das ACN Isokratische vs. Gradiententrennungen   Verfügen Sie nicht über einen Degasser und ist Ihnen Helium zu teuer, verwenden Sie einfach (sauberen!) Stickstoff. Er ist billig und leistet tolle Entgasungs-Dienste. Ein kleines Problemchen kann allerdings dabei auftauchen: Manche Pumpe „verschluckt“ sich etwas häufiger Ein Ultraschallbad ist bekanntlich als Entgasungs-Tool alleine recht uneffektiv. Es hat sich jedoch gezeigt, dass bei gepufferten Eluenten eine etwa 5-min Entgasung nach einer Vakuum-Filtration zu einer besseren Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten führt. Offensichtlich wird durch diese Prozedur eine gleichbleibende CO2-Konzentration und damit ein konstanter pH-Wert des Eluenten erreicht….

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9. Juli 2002

Muss es immer Kaliumphosphat sein?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Ein beliebter Puffer in der Routine-RP-Chromatographie ist zweifelsohne Kaliumphosphat: Kaliumdihydrogen- für den sauren, Dikaliumhydrogenphosphat für den neutralen/schwach-alkalischen Bereich. Eine Klarstellung vorweg: Wenn Sie mit „Ihrem“ Kaliumphosphatpuffer zufrieden sind, so ändern Sie um Gottes Willen nichts, verfahren Sie weiterhin wie gehabt und schauen Sie sich andere HPLC-Tipps an. Sollten Sie jedoch nicht ganz glücklich sein, so denken Sie vielleicht (sofern Sie etwas ändern dürfen… ) an Ammoniumphosphat, es hat gegenüber Kaliumphosphat einige Vorteile. Welche sind das? Die Lösung Ammoniumphosphat ist in höherer Reinheit erhältlich, dadurch treten bei empfindlichen Gradiententrennungen seltener Störpeaks auf Ammoniumphosphat ist besser löslich, dadurch besteht bei…

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5. Juni 2002

Überprüfung der Peakhomogenität – die etwas aufwendigeren Maßnahmen

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über schnelle Möglichkeiten zur Überprüfung der Peakhomogenität nach einer erfolgten Trennung unterhalten. Dabei blieb des chromatographische System mehr oder weniger unverändert. Heute geht es um etwas aufwendigere Maßnahmen. Die Lösung 1. Änderung des Eluenten Zweifelsohne ist eine pH-Wert-Änderung die effektivste Möglichkeit, die Selektivität von ionischen oder auch von lediglich polaren Analyten zu verändern. Vorschlag: ± 0,5 oder ± 1 pH-Einheit bei sonst konstanten Bedingungen. Als zweite, relativ einfache Möglichkeit wäre folgende zu nennen: Belassen Sie es bei dem ursprünglichen pH-Wert, stellen jedoch jenen mit einer anderen Säure/Base ein, z. B. statt mit…

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9. Mai 2002