- Säurezusatz im Eluenten
- Gefahr für Niederschläge
- Vorsäule ja, aber was für eine?
Alternativen zu TFA
Trifluoressigsäure (TFA) wird gerne zum Ansäuern in der RP-HPLC verwendet, häufig bei – eventuell erst in der Zukunft geplanten – LC-MS-Kopplungen. TFA bereitet jedoch bekanntlich einige Probleme, so in etwa Basisliniendrift, immer wieder Empfindlichkeitsverlust, TFA kann lange auf der Säule bleiben usw. Welche Alternativen hätten wir? Wenn Ameisensäure für bestimmte Trennungen nicht sauer genug ist, könnte man an Pikrin- oder an Sulfamin- oder an Difluoressigsäure (DFA) denken. Ferner – sollte ein Ionenpaarreagenz benötigt werden – an Methansulfonsäure. Noch ein Wort zu Phosphatpuffer: Phosphorsäure bzw. ein Phosphatpuffer bewährt sich seit langem in der RP-HPLC mit UV-Detektion. Sollten Sie mit der Trennung bzgl. Selektivität/Peakform bei Anwendung von Phosphorsäure oder Phosphatpuffer zufrieden sein, könnte man getrost eine LC-MS-Trennung wagen: Bei einer Verwendung von ca. 10 mM Phosphatpuffer müsste man erst nach 4-5 Stunden das Interface reinigen. Merke in diesem Zusammenhang folgende generelle Regel: Je ähnlicher der pH-Wert des Eluenten zum pKS-Wert des verwendeten Puffers ist, desto niedriger kann die notwendige Pufferkonzentration sein. Dennoch gilt: Das Dilemma gutes chromatographisches Ergebnis vs. Reinigungs-Aufwand kann nur individuell gelöst werden.
Niederschlag
Eine Verstopfung im Gerät durch einen Niederschlag ist immer ärgerlich. Es liegt auf der Hand, dass diese Gefahr mit steigender Puffer- und Acetonitril-Konzentration sowie bei niedrigen Temperaturen zunimmt. Nachfolgend einige Hinweise:
- Ab ca. 85% Acetonitril in der mobilen Phase und ≥ ca. 20 mM Puffer nimmt das Risiko von Niederschlag im Falle von dünnen, ≤ ca. 0,13 mm Kapillaren stark zu
- „Phosphatpuffer“ – nur welcher? K2HPO4 (Pufferbereich: pH-Wert = 6,5-7,5) macht kaum Probleme, die Löslichkeit ist sehr gut. Na2HPO4 dagegen, insbesondere bei hohem ACN-Anteil und ≤ ca. 25 °C, kann definitiv Probleme bereiten, denn: Die Differenz der Löslichkeit der zwei Salze beträgt mehr als Faktor 20! Im sauren gibt es generell kaum Schwierigkeiten
- Ammoniumacetat bei ≥ ca. 60% ACN: Farblose Kristalle, die beispielsweise in der Mischkammer ausfallen
Die „geeignete“ Vorsäule
Oft wird eine Vorsäule zum Schutz der Hauptsäule eingesetzt. Das Material der Vorsäule muss nicht unbedingt identisch mit dem der Trennsäule sein, es ist Regel-konform, wenn es z. B. auch „C18“ ist. Warum nicht identisch? Die Vorsäule hat in der Regel die Aufgabe, ziemlich „viel“ von der störenden Matrix zu adsorbieren, dabei soll sie nach Möglichkeit wenig Druck aufbauen. Diese Anforderungen führen zu folgenden sinnvollen Charakteristika für eine Vorsäule:
- Gute Beladbarkeit: Dazu soll das Material der Vorsäule eine möglichst große spezifische Oberfläche aufweisen, z. B ≥ 250 m2/g
- Große Bindungskapazität: Die Beladungsdichte des Materials sollte über 3 mMol/m2 der Kohlenstoffgehalt über ca. 18-20% C betragen
- Im Falle von Gradiententrennungen spielt die Teilchengröße eine untergeordnete Rolle. Somit kann die Teilchengröße in der Vorsäule ruhig 5 µm betragen, auch dann, wenn die analytische Säule 3 µm-Teilchen oder kleiner enthält. 5 µm- Teilchen sind haltbarer als 3 µm und bauen einen geringeren Druck auf.
Wird eine Vorsäule nicht zum Schutz der Hauptsäule, sondern zu einer Verbesserung der Trennung von sehr polaren Komponenten – also Elution solcher um oder kurz nach der Totzeit – eingesetzt, sollte das Material natürlich polarer als jenes der Hauptsäule sein. Im Falle einer C18-Hauptsäule kämen somit folgende Phasen für die Vorsäule in Frage:
CN, Phenyl-Hexyl, PFP, Hypercarb, Kieselgel oder Mixed-Mode.
