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Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…

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14. Oktober 2003

Muss es eigentlich immer HPLC sein?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung

Manche(r) fragt sich: „Was soll das für eine komische Frage und gar als HPLC-Tipp?“ Na ja, schauen wir mal. Der Fall Sie bestimmen den Gehalt eines Wirkstoffs, beispielsweise aus einer Tablette oder nach einer Freisetzung. Oder Ihre Aufgabe besteht darin zu überprüfen, ob der Kessel vor der nächsten Produktionscharge wirklich sauber ist (Reinigungsvalidierung). Wie auch immer, Sie erhalten einen einzigen Peak. Sie verwenden also eine kurze Säule, sagen wir 50 mm, das Chromatogramm dauert nicht lange, sagen wir 6 min. Wenn alles gut läuft und Sie sonst zufrieden sind, dann besteht in der Tat kein Handlungsbedarf. Sie brauchen nicht weiter…

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15. September 2003

Überbefund bei Gehaltsbestimmung – eine tückische Ursache

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Sie arbeiten mit einem ganz normalen linearen Gradienten und Ihr Ziel ist die Gehaltsbestimmung von mehreren Peaks. Ihre Anlage ist qualifiziert und Sie wissen, Ihr Probengeber und Ihre Pumpe arbeiten Einwand-frei. Der Gehalt einiger Peaks ist OK, bei einigen oder bei einem finden Sie jedoch einen leichten aber reproduzierbaren und signifikanten Überbefund. Sie können durch mehrere Versuche alle, Ihnen bekannte Ursachen, ausschließen. Gibt es noch weitere „verrückte“ Ursachen für dieses Phänomen? Die Lösung Wahrscheinlich jede Menge – dafür ist HPLC bekanntlich ein Buch mit 14 Siegeln! Ich möchte Ihnen hier eine nennen: Fahren Sie einen Blindgradienten, wichtig dabei…

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10. August 2003

Wieso ist der pH-Wert so wichtig, was bewirkt er eigentlich?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Alle diejenigen, die mit polaren/ionischen bzw. ionisierbaren Analyten zu tun haben wissen, dass der pH-Wert des Eluenten ein sehr wichtiger Faktor ist. Was bewirkt er jetzt genau? Hinweis 1: Mit diesem Thema kann man mindestens ein Tagesseminar bzw. einen 10-seitigen Artikel problemlos füllen. Nachfolgend werden nur einige wenige, grundsätzliche Dinge angesprochen. Hinweis 2: Wir beschränken uns auf die RP-HPLC; bei der Ionenaustausch- und Ionenchromatographie herrschen klare, „geordnete“ Verhältnisse, es gibt wenige Probleme, da in der Regel nur ein Mechanismus, eben Ionenaustausch vorliegt. Die Lösung Der pH-Wert beeinflusst den Dissoziationszustand von sauren/alkalischen Komponenten sowie der freien Silanolgruppen (Rest-Silanolgruppen) an…

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7. Juli 2003

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Hintergrund Wichtig in der HPLC sind „vernünftige“ Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor k, von ca. 2-8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor : k = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung) tG = Gradientendauer [min] F = Fluss [ml/min] Vm = Säulenvolumen Δ%B = Änderung von B während der Gradientelution S = Steigung der -Kurve; für kleine Moleküle kann für ein Wert von ca. 5 angenommen…

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14. Juni 2003

Trennung von isomeren Verbindungen

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Die Trennung von isomeren Verbindungen kann sich als ein recht schwieriges Trennproblem erweisen. Das liegt u.a. daran, dass die Eigenschaften von Isomeren häufig sich stark ähneln. Welche Säulen bzw. Eluenten kämen nun in Frage? Die Lösung Vorbemerkung: Schwierige Fälle bedürfen oft unorthodoxen Lösungswegen. Diese allgemeine Maxime gilt auch hier – vor allem, wenn es um einen einmaligen, wichtigen Fall geht (Reklamation, Toxizitätsproblematik) und nicht um die Entwicklung einer Routinemethode, bei der Robustheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im Vordergrund stehen. Also, wundern Sie sich bitte nicht ob einiger meiner Vorschläge! Säulenauswahl Hydrophobe Phasen sind hier kaum geeignet, denken Sie…

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5. Mai 2003

Tailing in der RP-HPLC Teil 2: Weitere Ursachen und bewährte Maßnahmen

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Tailing ist eines der ärgerlichsten Dinge in der RP-HPLC. In diesem HPLC-Tipp haben wir uns mit effektiver Ursachenforschung beschäftigt. Heute wollen wir uns ein paar weitere generelle Gründe für Tailing und einige bewährte Maßnahmen zu seiner Aufhebung anschauen, siehe Tab.1 Die Lösung Abb. 1 Typische Peakformen von stärkeren Basen an einer hydrophoben, gut abgedeckten C18 Phase (links) und an nicht endcappten Phase (rechts) Abb. 2 Ein Chromatogramm aufgenommen bei verschiedenen Wellenlängen – je nach eingestellter Wellenlänge ergibt sich eine symmetrische bzw. eine „unmögliche“ Peakform. Das Fazit Nachlassende Packungsqualität und ungewollte pH-Wert-Verschiebung dürften in der Routine-RP-HPLC die wichtigsten Ursachen…

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9. April 2003

Tailing in der RP-HPLC Teil 1: Schnelle Ursachenforschung

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Nehmen wir an, Sie erhalten bei der Injektion einer unbekannten Probe einen tailenden Peak. Die Peakform ähnelt einer der in Abb. 1 dargestellten Formen. Wie könnte man nun schnell die Ursache für das Tailing identifizieren? Abb.1 Typische tailende Peakformen in der HPLC Die Lösung Die häufigsten Ursachen für Tailing sind: Zweite Komponente an der Flanke, d.h. ungenügende Auflösung Überladung der Säule (Bemerkung: bei einer Überladung des Detektors erhalten wir meist breite, „rundliche“ aber eher symmetrische Peaks Chemisches Tailing, z. B. zusätzliche ionische/polare Wechselwirkungen zwischen einer Base und den Restsilanolgruppen der stationären Phase Die Packungsqualität hat nachgelassen, d.h. Auftreten…

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9. März 2003

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 2

Von B Optimierung, HPLC-Tipps

Der Fall Die Peaks machen am Ende einer Trennungsoptimierung einen „ordentlichen“, symmetrischen Eindruck, auch die Auflösung zwischen den Peaks ist zufriedenstellend. Wie können Sie nun mit einem vertretbaren Aufwand überprüfen, ob alle vorhandenen Komponenten tatsächlich sichtbar sind? Die Lösung Es gibt zweifelsohne eine Reihe möglicher Wege: Von einer Änderung der chromatographischen Parameter (z.B. pH-Wert, Temperatur, stationäre Phase) bis hin zu Kopplungstechniken wie LC-MS. Je nach Umfeld, Wichtigkeit der Probe etc. mag die eine oder andere Massnahme richtig bzw. gerechtfertigt sein. Nachfolgend ein Vorschlag, der sich relativ leicht realisieren lässt: Sie wiederholen die Trennung bei einer möglichst unterschiedlichen Kombination Säule –…

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9. Februar 2003

Selektivität „nur“ durch unterschiedliche Wechselwirkungen?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Säulenauswahl

Der Fall Wir haben alle gelernt, dass – außer vielleicht bei der Ausschluss- und der Affinitätschromatographie – eine chromatographische Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen der zu trennenden Analyte mit der stationären Phase zustande kommt. Dabei werden je nach Mechanismus stark ionische bis stark hydrophobe Wechselwirkungen angenommen. Verteilungsmechanismen sind bei der HILIC ein Thema, sonst finden sie wenig Erwähnung. Sind aber lediglich Wechselwirkungen alles was die Selektivität beeinflusst? Die Lösung Nein. Auch für kleine Moleküle können sterische Aspekte von Bedeutung sein, siehe dazu Abb. 1. Bei der Trennung einer Mischung von Metaboliten von tricyclischen Antidepressiva, also durchaus kleine Moleküle, werden an zwei „polaren“…

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4. Januar 2003