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Erniedrigung der Nachweisgrenze durch Optimierung der Injektion

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Optimierung

Der Fall Die Verbesserung der Peakform ist in der Spurenanalytik (Reinheit, Stabilitäts- und Toxizitäts-Untersuchungen, Reinigungsvalidierung, Umweltanalytik) wichtiger als sonstwo. Denn wenn ich bei konstant injizierter Menge – und damit gleicher Fläche – einen scharfen und damit höheren Peak erhalte, ist die Quantifizierung mit einem kleineren Fehler behaftet. Es existieren einige bewährte Maßnahmen, die zu schmalen Peaks führen, z. B. dünnere Säulen, kleinere Teilchen, Erniedrigung des Totvolumens der Apparatur, Optimierung der Detektion, Verbesserung der Kinetik (Temperatur, Modifier) usw. Heute werden wir uns mit ein paar einfachen Tricks beim Injizieren beschäftigen. Die Lösung Es gibt zwei Ansätze: 1.) Verdünnung der Substanzzone verhindern…

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14. November 2000

Peaks kommen zu spät – was tun?

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine Trennung mit einer guten Auflösung erzielt. Die nächste Frage könnte (sollte!) wie folgt lauten: „Wie kann ich am unproblematischsten die Analysenzeit verkürzen?“ Die Lösung Ganz einfach: Fluss erhöhen. Es ist mir bewusst, dass vielen LeserInnen diese Antwort recht banal erscheint. Im Grunde genommen ist sie es auch. Dennoch macht es Sinn darauf hinzuweisen, denn es existieren für meine Begriffe weltweit einfach viel zu viele Prüfvorschriften mit „Fluss: 1 ml/min“. Eine Flusserhöhung führt stets zu Zeitersparnis oder beim Gradienten sogar zur Verbesserung der Auflösung (siehe weiter unten), die Nachteile, die man sich einhandelt, sind gering –…

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8. Oktober 2000

Die richtige Wellenlänge – „es ist eine alte Geschicht´, doch bleibt sie immer neu“

Von B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Wellenlänge

Der Fall Ich habe wirklich lange mit mir selber gerungen, ob ich diese Trivialität als „HPLC-Tipp“ schreiben soll. Nachdem ich mich jedoch vor kurzem einen halben Tag „dumm und dämlich“ nach verlorenen Peaks gesucht habe und ich sämtliche mir bekannte griechische, deutsche und saarländische Schimpfworte losgeworden bin, wage ich es doch. Meine Lehre daraus ist: Fangen Sie bitte an, eine Trennung zu optimieren oder nach einem Fehler zu suchen erst dann, wenn Sie 100 % sicher sind, dass die eingestellte Wellenlänge optimal beziehungsweise richtig ist. Übertreibe ich vielleicht ein bisschen? Die Lösung Ich denke nein, es sei denn, Sie sind…

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15. August 2000

Einstellparameter einer HPLC-Apparatur

Von B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration

Der Fall Die Einstellparameter eines analytischen Instruments sind wichtig, das ist sicherlich geläufig. Dennoch mache ich die Erfahrung, dass jene leider nicht immer den Applikations-relevanten optimalen Wert haben. Das ist schade, denn häufig führen solche legale „Manipulationen“ zu ausreichender Auflösung ohne z. B. Säule oder Eluent wechseln zu müssen. Um welche Einstellungen geht es konkret? Die Lösung Ich denke, wir können auf das Eingeben von selbstverständlichen Parametern  wie z.B. Fluss, Temperatur oder Injektionsvolumen verzichten. Nachfolgend eine kurze Übersicht über einige Parameter der „zweiten“ Reihe. Zu jedem Punkt der Tabelle gibt es schöne Beispiele, greifen wir hier die Zeitkonstante („time constant“,…

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14. Juli 2000

Verschiebung des pH-Wertes im Eluenten – Gründe und Ausmaß

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Je mehr ich mich mit der Rolle des pH-Wertes befasse, um so „erschreckender“ wird für mich die Erkenntnis, wie schwerwiegend und diffizil sein Einfluss auf die Trennung von sauren und alkalischen Komponenten in der RP-HPLC ist… Hier wollen wir einen einzigen Aspekt herauspicken und zwar die Gründe für seine ungewollte Verschiebung. Also: Wann müssen wir mit einer pH-Wert-Verschiebung rechnen? Die Lösung Dazu gleich die Ergebnisse einiger Experimente, die ich in letzter Zeit durchgeführt habe: Was sind die Konsequenzen? Eine unkontrollierte pH-Wert-Verschiebung kann die Robustheit der Methode beeinträchtigen, d. h. es können sowohl die Retentionszeit als auch die Selektivität…

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7. Juni 2000

Peakdeformation und Retentionszeitverschiebung aufgrund eines ungeeigneten Probelösungsmittels

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Sie arbeiten mit einer einfachen, robusten Methode. Auch Ihre Säule ist recht neu. Dennoch eluieren alle oder ein Teil Ihrer Peaks mit einem Fronting und/oder die Retentionszeiten sind nicht konstant. Was könnte der Grund sein? Die Lösung Ein Fronting (das Gegenteil von Tailing, manchmal als „Fronttailing“ bezeichnet) ist fast immer als sicherer Hinweis anzusehen, dass Probelösungsmittel und Eluent nicht identisch sind. Oder noch konkreter, das Probelösungsmittel ist stärker als der Eluent. Sie arbeiten beispielsweise mit MeOH/H2O oder ACN/H2O beziehungsweise Puffer als Eluent und die Probe ist in reinem Methanol oder Acetonitril gelöst. Ergebnis: Fronting oder sogar Doppelpeaks, evtl….

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10. Mai 2000

Nicht-endcappede Phasen – „ad acta“ legen?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuartiger C18-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappte sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell-, monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl ist? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als alte Technologie „ad acta“ legen? Die Lösung Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer…

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5. April 2000

Warum verschiebt sich der pH-Wert trotz richtigem Puffer und ausreichender Pufferkapazität?

Von A Fehlersuche, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten mit einem RP-System und folgendem Eluenten: MeOH (oder Acetonitril)/ Kaliumdihydrogen-Phosphatpuffer, pH = 7,5, 45/55 (v/v) und trennen basische Substanzen. Die Trennung ist gut, viel zu gut. Also erhöhen sie – um Zeit zu gewinnen – den Methanolanteil auf 80 % oder Sie fahren einen 40 → 80 % MeOH-Gradienten bei sonst gleichen Bedingungen … und Sie verstehen die Welt nicht mehr: Die Basen kommen nicht einfach früher wie es sich gehört. Nein, alle oder ein Teil davon macht riesige Retentionszeit-Sprünge nach hinten und/oder die Selektivität ändert sich und/oder die Säule hält nicht mehr so lange und so…

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7. März 2000

Wie trenne ich Säuren mittels RP C18?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten organische Verbindungen mit saurem Charakter trennen. Die Rede ist nicht von Aminosäuren oder organischen/anorganischen Säuren. Für diese Substanzklassen existieren sehr gute Standardapplikationen. Bei Ersteren erfolgt die Trennung durch Vor- beziehungsweise Nachsäulederivatisierung und Gradientelution. Letztere werden an starken/schwachen Ionenaustauschern getrennt. Welche RP-Systeme könnten nun in Frage kommen? Die Lösung Man nehme wie folgt: Die Säule Nicht endcappede, „klassische“ Säulen, weil diese im Sauren, siehe weiter unten, stabiler als endcappede sind oder einige moderne, speziell für den Einsatz im Sauren entwickelte Säulen, es sei hier je ein Vertreter genannt: LiChrospher, Zorbax SB. Der Eluent Es…

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5. Februar 2000

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“: Säulen- und Eluentenauswahl

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

These: Es ist realistisch, eine Methode innerhalb von zwei Arbeitstagen zu ca. 80% zu entwickeln. Betrachten wir folgenden fiktiven Fall (Siehe für eine  kürzer-gefasste Version dieses Konzepts diesen HPLC-Tipp): Der Fall Ihr Chef kommt Dienstag Morgen recht konsterniert ins Labor, überreicht Ihnen eine ganz, ganz wichtige Probe direkt aus der Synthese und fleht Sie an, eine Trennung bis morgen Abend irgendwie hinzukriegen. Er fliegt am Donnerstag früh in die Staaten und bräuchte dringend die Information über die Anzahl der Probenbestandteile, es geht also um qualitative Analyse. Eigentlich ist Ihr Chef ein netter Mensch und das ist nicht seine Art, also…

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8. Januar 2000