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C – Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise

Der Elefant, der Streitsüchtige, der Enthaltsame und der Gesellige oder: Peaks vor der Front?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit

Der Fall Wir wissen alle, was die Totzeit, t0 , (Front, Frontpeak, Durchbruchzeit, Mobilzeit, Lösungsmittelpeak, „Luftpeak“) bedeutet: Das ist die Aufenthaltszeit einer Substanz im Eluenten. Also die Zeit, die eine Substanz benötigt, um vom Injektionspunkt bis zum Detektor zu gelangen  – falls die Substanz nicht an der stationären Phase „hängen“ bleibt: Eine solche Komponente verhält sich im gegebenen chromatographischen System inert. Das ist logischerweise gleichzeitig die Elutionszeit für ein Eluentenmolekül. Konsequenterweise dürfte keine Substanz vor t0 eluieren, sie kann ja nicht schneller sein, als z. B. ein Methanolmolekül – oder doch? Die Lösung Ja, Peaks vor der Front sind in der…

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Zusätze im Eluenten

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Bei der Herstellung von Eluenten werden immer wieder bestimmte Zusätze (Additiva, „Modifier“) verwendet. Das sind kleine Mengen bestimmter Substanzen – in der Regel im Promille- oder im unteren Prozentbereich -, die einem meist binären Eluenten zugesetzt werden. Wann ist dies notwendig und was bewirken diese Zusätze? Die Lösung Die HPLC-Trickkiste ist unerschöpflich. Die Hauptziele dabei sind: eine bessere Peakform und eine Änderung der Selektivität. Nachfolgend finden Sie in tabellarischer Form für häufige Anwendungen bewährte Zusätze. Häufige Zusätze im Eluenten Das Fazit Kleine Zusätze haben oft eine große Wirkung. In Hinsicht auf Robustheit beachten Sie bitte jedoch folgendes: Nach…

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Algen, Pilze und Bakterien in der HPLC

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Sobald Wasser und insbesondere Pufferlösungen stehen gelassen werden, besteht die Gefahr, dass Mikroorganismen wachsen. Ergebnis: Erhöhter Druck, Geisterpeaks, „Buckel“. Wie verhindert man deren Wachstum und wie wird bei Bedarf dieser Mini-botanischer Garten zum Verlassen der Anlage bewegt? Die Lösung In folgenden Situationen fühlt sich manches Tierchen und Pflänzchen wohl: Ruhendes Gewässer, sonnige Plätzchen, gemütliche Ecken – am besten mit Versteckmöglichkeiten, unebenes Gelände, was bedeutet: Stehender Eluent, Tageslicht (z. B. Pufferlösung auf der Fensterbank), Fritten, Fittings, Mischkammer sind ausreichend vorhanden, rauhe, schmutzige Oberflächen in der Anlage. Für Speise und Trank ist bestens gesorgt, was bedeutet: Es werden Pufferlösungen serviert …

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Die Nitrilphase – manche mögen es polar.

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Für viele Anwender sind restliche RP-Phasen außer den gewohnten C18 oder C8 exotisch. Sind sie auch. Die Nitril- oder Cyanophase ist eine solche polare Phase. Wann wäre ihr Einsatz nun sinnvoll (siehe auch diesen HPLC-Tipp)? Die Lösung Die Nitrilphase hat sowohl eine polare als auch eine apolare Funktionalität: Die CN-Gruppe ist für den polaren, die Propylgruppe (der Tracer zwischen der CN-Gruppe und der Kieselgeloberfläche) für den apolaren Charakter zuständig. Somit steht CN bezüglich Polarität zwischen beispielsweise einer Aminophase und Kieselgel. Das bedeutet: Wenn bestimmte apolare Komponenten zu stark mit C18 oder C8 wechselwirken (unangenehm lange Retentionszeiten), wäre an…

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Spülen einer HPLC-Anlage

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Spülen ist sicherlich eine der besten präventiven und kurativen Maßnahmen in der HPLC. Während für die meisten Anwender der Spülschritt bei einer Gradientenelution am Ende des Laufs einfach dazugehört, erfolgt bei isokratischen Trennungen ein solcher in der Regel erst bei Bedarf, was aus ökonomischen Gesichtspunkten auch richtig ist. Schauen wir uns doch an, an welchen Symptomen dieser „Bedarf“ erkannt wird, was die Ursachen sind und wie gespült werden sollte. Bemerkung: Einige der unten aufgeführten Symptome (z. B. Tailing, Änderung der Retentionszeit) können natürlich auch andere Ursachen haben. Die Lösung Tab. 1: Spülen einer HPLC-Anlage Das Fazit Mit sauberem…

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Probenvorbereitung — wie kritisch sind welche Fehler?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Probenlösungsmittel

Es gibt glückliche Anwender, die ihre Probe im Eluenten auflösen und direkt injizie­ren können. Wenn Sie zu diesen gehören und Sie noch einen isokratischen ACN/H2O-Lauf haben, können Sie recht getrost das Wort „Probenvorbereitung“ vorerst verges­sen. Es gibt wiederum Anwender, die aus Galle die Nebenkomponente eines metabolisierten Metaboliten quantifizieren müssen, und andere, die Heterocyclen mit Schwe­felatomen im Erdölrückstand des irakischen im Vergleich zum libyschen Erdöl auf­spüren müssen. Ihnen gehört unsere ganze Sympathie. Nachfolgend einige typische Fehlerquellen im Rahmen einer normalen Probenvorbereitung in tabellarischer Form. Tab. 1: Typische Fehlerquellen bei der Probenvorbereitung Lösen von Proben Herstellung von Eluenten Einige weitere beachtenswerte Punkte:…

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Ist die vorliegende Methode eine robuste Methode?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Robustheit

Der Fall Die Kollegen aus der Entwicklung schicken Ihnen eine Methode oder der Chef kommt triumphierend in das Labor mit der Kopie einer Methode in der Hand und sagt: „Machen Sie mal.“ Oder Sie bekommen den neuesten Prospekt der Firma Fanta­siechrom GmbH mit der Abbildung eines Chromatogramms samt Methode, die Sie gut gebrauchen können. Bevor Sie irgend etwas Chromatographisches anfangen, wür­de ich Ihnen dringend empfehlen, die Methode bei einer Tasse Kaffee/Tee etwas genauer anse­hen. Die Lösung Bei einigen Methoden weiß man/frau von Anfang an, dass sie kaum robust sein können. Wenn Sie dennoch die Methode übernehmen müssen, sollten Sie wenigstens…

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Wie wähle ich meine HPLC-Anlage bzw. meinen HPLC-Lieferanten aus?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Vielleicht haben Sie demnächst beim Kauf einer Anlage zu entscheiden, welches Ge­rät gekauft wird, oder Sie sollen für den Chef die Entscheidung vorbereiten. Auch für erfahrene Anwender kann dies bei der aktuellen Anzahl von Herstellern und Gerätetypen zu einem großen Problem werden. Welche Fragen sollten Sie im Vorfeld für sich abklären? Die Lösung Wir gehen in dem konkreten Fall davon aus, dass die Entscheidung für die HPLC als die geeignete Methode für Ihr Trennproblem richtig ist – nicht immer eine triviale Entscheidung. Man sollte bei dem Kauf sowohl Kriterien allgemeiner Natur als auch wissenschaftlich-technische Forderungen berücksichtigen. Zu den…

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Maximal zulässiges Injektionsvolumen ?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung

Der Fall Durch die Art der Probenvorbereitung erhalten Sie eine stark verdünnte Probelösung oder Sie haben mit der Nachweisgrenze zu kämpfen, jedenfalls würden Sie gerne aus bestimmten Gründen ein relativ großes Probevolumen direkt injizieren. Wie groß darf dieses Volumen sein, ohne dass Sie sich dadurch eine merkliche Peakverbreiterung einhandeln? Wir setzen voraus, dass die Säule nicht überladen ist; hier ist also die Rede von einer evtl. Peakverbreiterung nur aufgrund der Injektion. Die Lösung Man kann über die Varianten der einzelnen Beiträge zur Peakverbreiterung das zuläs­sige Injektionsvolumen ausrechnen. Das ist möglich, da wir in der HPLC stochastisch unabhängige Prozesse haben. Nur…

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Wie teste ich eine HPLC-Anlage und auch die einzelnen Mo­dule?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen

Der Fall Eine elementare Voraussetzung für eine richtige und präzise Analytik ist eine gut funktionierende Meßapparatur. Die einfachste und sicherste Methode zu deren Überprüfung ist die zweifache Injek­tion einer bekannten Probe, Standard- oder Kontrollprobe. Sind die erhaltenen Chromatogramme identisch mit einem Chromatogramm, das Sie bei einem einwandfreien Zustand der Anlage, z. B. nach einer Wartung, erhalten haben, bedarf es ei­gentlich keiner weiteren Überprüfung. Als Vergleichskriterien eignen sich: Retentionszeit, Peakfläche und -höhe, Asymmetriefaktor. Abweichungen, die noch zu ak­zeptieren sind, sind genau festzulegen. Gibt es solche, muss der aktuelle Zustand der HPLC-Module überprüft werden. Wel­che Tests eigenen sich dafür? Die Lösung Tab….

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