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A Fehlersuche

Systematische Vorgehensweise beim Auftreten von Problemen

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten im Routinelabor und stehen immer wieder vor Problemen. Natürlich wäre optimal, wenn Sie sofort die Lösung hätten. Sofort-Lösungen zu erhalten ist jedoch äußerst selten im Leben und konkrete Tipps bekommen Sie (vielleicht) beim Studium von Fachbüchern, von erfahrenen KollegInnen oder im Rahmen von Weiterbildungsveranstaltungen. Nachfolgend schlage ich Ihnen ein Strategie-Schema vor, wie man vorgehen kann. Auch wenn es auf den ersten Blick theoretisch und recht allgemein erscheinen mag, hilft eine solche oder ähnliche systematische Vorgehensweise sehr. Diagnose von und Umgang mit HPLC-Fehlern Problem wiederholbar? Wann tritt das Problem auf? Nur freitags, nur bei mir usw? Symptome…

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9. Mai 1999

Was ändert sich am Chromatogramm, wenn das Totvolumen einer isokratischen Anlage größer ist als bei einer anderen?

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine isokratische Methode soll auf ein anderes Gerät übertragen werden; die aktuelle Apparatur weist ein um 100 μl größeres Totvolumen auf, als die Apparatur, an der die Methode entwickelt wurde. Muss man mit merklichen Unterschieden im Chromatogramm rechnen und wenn ja mit welchen? Die Lösung Ein Totvolumen führt bekanntlich zu Peakverbreiterung, die Auflösung wird schlechter evtl. sogar unzureichend bei früh eluierenden, kritischen Peaks. Was kann noch passieren? Die Retentionsfaktoren (k-Werte, relative Retention) nehmen auch ab. Erläuterung: Es gilt: k Retentionsfaktor (früher: Kapazitätsfaktor, k‘) tR Retentionszeit einer Komponente tm Totzeit (Retentionszeit einer inerten Komponente) Durch eine Vergrößerung des Totvolumens…

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10. Januar 1999

Die Peaks kommen mit der neuen, „identischen“ Säule später – warum?

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine neue Säule bestellt, die soeben angekommen ist. Obwohl Sie die gleiche Säule (stationäre Phase und Säulendimensionen) bestellt haben, und Sie dem Lieferanten auch treu geblieben sind, kommen die Peaks trotz konstant gehaltener chromatographischer Bedingungen später. Warum? Die Lösung Nehmen wir an, dass die chromatographischen Bedingungen (Temperatur, Eluent incl. pH-Wert, Pufferstärke usw. ) und auch die Probenvorbereitung tatsächlich konstant geblieben sind. Überprüfen Sie nun, ob die Totzeit (Frontpeak, Durchbruch) auch später eluiert. Ist das der Fall, dann ist wahrscheinlich der Fluss nicht mehr konstant: Schauen Sie nach Luft in der Pumpe bzw. nach einer Leckage. Stellen…

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14. August 1998

Ungewollte pH-Verschiebung – die Konsequenzen

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die unbeabsichtigte pH-Verschiebung im Eluenten ist einer der häufigsten Gründe für mangelnde Robustheit in der RP-Chromatographie. In diesem HPLC-Tipp geht es um die Ursachen für eine pH-Verschiebung sowie über das Ausmaß. Hier wollen wir uns etwas genauer mit der Änderung der Peakgröße befassen. Die Lösung Eine pH-Wert-Verschiebung kann zu unterschiedlicher Signalgröße (Peakfläche) führen, denn die UV-Absorption polarer Komponenten kann pH-Wert abhängig sein. In Abb. 1 wird das Spektrum der L-Ascorbinsäure bei unterschiedlichen pH-Werten gezeigt. Betrachten wir den pH-Wert-Bereich, der für die HPLC relevant ist, pH = 2-9. Im Alkalischen hätten wir beispielsweise bei 240 nm einen kleinen Peak,…

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7. Juni 1998

Wann ändert sich die Peakfläche?

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Wellenlänge

Der Fall In der quantitativen HPLC wird der Gehalt nahezu ausschließlich über die Peakfläche bestimmt. Ändert sich die Peakfläche nicht ausschließlich aufgrund einer unterschiedlichen Injektionsmenge/Konentration – wie es ja sein sollte – erhält man falsche Ergebnisse. Wann kann dies passieren? Die Lösung Ursachen für eine Änderung der Peakfläche: Änderung der Injektionsmenge/des Injektionsvolumens, Änderung der Konentration (evtl. ungewollt durch verdampfen von Lösungsmittel…) Änderung des Flusses (konzentrationsempfindliche Detektoren) Änderung der Wellenlänge Änderung des pH-Wertes irreversible Adsorption ungeeignetes Probelösungsmittel Kurze Kommentierung der einzelnen Fälle: 1., 2. und 3. Das sind die Haupteinflussgrößen apparativer Natur, die eine unbeabsichtigte Änderung der Peakfläche und damit zu falschen…

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10. Februar 1998

Wann müssen wir mit einer Änderung der Elutionsreihenfolge rechnen?

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Im Zuge einer Optimierung ändern Sie z. B. den Wasseranteil im Eluenten oder dessen pH-Wert oder einfach die Temperatur. Ziel ist dabei eine Verbesserung der Auflösung durch Änderung der Retentionszeiten. Nun müssen wir bei solchen Optimierungs-Schritten aber auch mit Elutionsumkehr rechnen, die dann zur Verwechslung von Peaks führen kann („Peaktracking“)! Wann ist das konkret der Fall? Die Lösung Jedesmal, wenn ein Parameter geändert wird, der einen Einfluss auf die Wechsel-wirkung zwischen Probe und stationäre Phase hat, müssen wir mit einer Elutionsumkehr rechnen. Das ist bei Änderung folgender Parameter der Fall: – Stationäre Phase • Hersteller, siehe Abb. 1…

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9. Januar 1998

Wo kommt ein Geisterpeak her?

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Der Fall Geister trifft man selten im Labor an – obwohl ich dem Verdacht nicht loswerde, dass sie dort doch des öfteren ihr Unwesen treiben… Geisterpeaks dagegen sind, leider Gottes, ganz quicklebendige Erscheinungen. Was sind Geisterpeaks? Das sind Peaks, die ganz unerwartet in dem Chromatogramm erscheinen. Wo kommen sie nun her und wie kann man deren Herkunft einreihen? (siehe auch diesen HPLC-Tipp). Die Lösung Die häufigsten Ursachen für Geisterpeaks sind: Verunreinigungen aus dem Eluenten, überschüssiges Ionenpaarreagenz usw. spät eluierende Substanzen Memoryeffekt durch Desorption einer Substanz aus der stationären Phase, aus einer Dichtung, einem Fitting, einer Fritte etc. Luftblasen im Detektor Zersetzungsprodukte…

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9. März 1997

Spikes im Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ihre Chromatogramme sehen recht anständig aus, doch ärgern Sie sich immer wieder über auftretende Spikes. Dies sind kleinere oder größere Striche, die häufig an verschiedenen Stellen im Chromatogramm erscheinen. Welche Ursachen können dafür verantwortlich sein und was kann man dagegen tun? Die Lösung Die Hauptursachen für Spikes sind: Luftblasen, Detektor, Elektronik, „Sonstiges“. Schauen wir uns die einzelnen Ursachen etwas genauer an. Luftblasen Einfacher Beweis für Luftblasen in der Pumpe (Δ tR): Wenn Sie die Pumpe ausschalten, sind auch die Spikes weg. Luftblasen im Detektor (Luftbläschen aus dem Eluenten direkt nach der Säule, „Ausgasen“) ergeben eine „unmögliche“ Basislinie, die…

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9. Februar 1997

Ist der linke oder der rechte Pumpenkopf defekt?

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe

Der Fall Die Ein- und Auslassventile sind die Schwachpunkte Nr. l jeder HPLC-Pumpe. Wenn Sie nun Flussschwankungen festgestellt und Luft als Ursache ausgeschlossen haben, bleibt Ihnen nichts anderes übrig, als in den sauren Apfel zu beißen und den Pumpen­kopf auseinanderzubauen (lassen). Viele der HPLC-Pumpen sind heute Doppelkolbenpumpen. Die Frage ist also, welcher Kopf muss ausgebaut werden, der linke oder der rechte? Zudem ist nun das Einlass- oder das Auslassventil verschmutzt? Eine 25%ige Chance, das richtige Teil auszubauen, ist zwar nicht schlecht, doch könnten Sie auch folgen­den Trick anwenden, um die Trefferquote zu erhöhen. Die Lösung Man saugt eine Luftblase von…

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29. Dezember 1996

Was sind die Gründe für Druckänderungen bzw. Druckschwan­kungen ?

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Die Druckänderung in dem Chromatographiesystem ist neben der Verschiebung der Retentionszeit eine der häufigsten Alltagsprobleme. Die Ursachen können vielfältig sein, sowohl mechanischer als auch chemischer Natur. Welche sind die häufigsten Ur­sachen? Die Lösung Ausführliche Auflistungen von möglichen Ursachen und deren Behebung finden sich in der Literatur z. B. in Dolan, Snyder „Troubleshooting LC-Systems“ und Unger, Weber „Handbuch der HPLC“. Tab. 1 ist eigens als schnelle Alltagshilfe erstellt. Zu Gunsten der Übersichtlichkeit sind nur die häufigsten Fehler aufgelistet; Ursachen, die selten vorkommen oder eher theoretischer Natur sind, blieben unberücksichtigt. Die Auswahl erfolgte nach persön­lichem Ermessen. Tab.1: Druckänderung in der…

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29. November 1996