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A Fehlersuche

Geisterpeaks beim Blindgradienten

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Es ist Usus vor einem Gradienten-Lauf einen „Blindgradienten“ zu fahren. Sollte nun bei diesem Testlauf die Drift auffallend stark sein oder gar Geisterpeaks erscheinen, besteht Handlungsbedarf, denn: Wir haben hier wahrscheinlich mit Kontaminationen zu tun. Wie könnte man jetzt den Herkunftsort der Kontamination ausfindig machen? Die Lösung Man verlängere die Equilibrierzeit vor der nächsten Injektion. Wird ein vorher festgestellter Geisterpeak größer oder nimmt die Drift zu, so liegt das Problem in der wässrigen/wasserreichen Phase. Knüpfen Sie sich die Reinheit des Wassers und eventuellen Zusätzen vor: Wasser mit UV-Licht bestrahlen falls Algen im Spiel sind, Patrone(n) aus der Milli-Q-Anlage…

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9. November 2002

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Säulenlagerung Geisterpeaks Saurer pH-Wert Änderung der Probelösung   Polare RP-Phasen, ob nicht-endcappte C18 oder polare „embedded phases“ oder welche mit kurzen Alkylketten usw. sollten Sie für längere Zeit, z. B. mehrere Monate, lieber in Mischungen des aprotischen Acetonitrils (ca. 70-80% ACN) und nicht des recht polaren Methanols lagern. Es besteht nämlich bei letzterem die Gefahr von Hydrolyse-Vorgängen, die Phasenoberfläche kann sich chemisch verändern Geisterpeaks zum Ersten: Sagen wir, Sie bekommen ungebetene, zusätzliche Peaks in Ihrem Chromatogramm, oder der Peak einer Komponente bekommt einen „Buckel“ usw. Sicherlich gibt es mehrere mögliche Ursachen dafür. Denken Sie bei Ihren Recherchen auch an die…

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9. August 2002

Reicht das Spülen der Säule mit Wasser bzw. mit Acetonitril aus?

Von A Fehlersuche, ACN, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Sie merken es am erhöhten Druck, an plötzlich auftretenden Geisterpeaks, an einer Peakverbreiterung: Sie haben es einfach mit „Dreck“ zu tun, es muss gespült werden. „Spülen in der HPLC“ ist offensichtlich ein stets aktuelles Thema. Jedenfalls wird in HPLC-Veranstaltungen immer wieder die Notwendigkeit und die Effektivität einzelner Spülschritte diskutiert. Eine häufige Frage bei HPLC-Kursen lautet: „Reicht es, wenn ich meinen Puffer und sonstige polare Verunreinigungen mit Wasser und meinen organischen „Dreck“ mit Acetonitril „herunter“ spüle?“ Die Lösung In aller Regel, ja. Wenn man allerdings mit hartnäckigen Verunreinigungen zu tun hat, kann es in der Tat sein, dass die…

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10. März 2002

Änderung nur der Peakhöhe bzw. nur der Peakfläche – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Für den Fall, dass auf ein Mal sowohl die Peakhöhe als auch die Peakfläche sich ändern gibt es eine Reihe von Ursachen, die jeder(m) erfahrenen Kollegin(en) sicherlich geläufig sind: verändertes Injektionsvolumen, instabile Probe, Leckage nach dem Injektor, evtl. Änderung vom pH-Wert (siehe diesen HPLC-Tipp), irreversible Sorption an „hungrigen Oberflächen“ (siehe diesen HPLC-Tipp), Änderung der Wellenlänge. Was bedeutet es aber, wenn nur die Peakhöhe bei konstanter Peakfläche bzw. die Peakfläche bei konstanter Peakhöhe sich ändert? Setzen wir voraus, dass Sie bewusst keine Hardware-Änderung vorgenommen haben, z. B. eine längere Säule oder eine Säule mit kleineren Teilchen eingesetzt. Vorbemerkung: Hier…

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10. Juli 2001

Fehlerquellen bei der Anwendung von Puffern

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Bei der Trennung von ionischen Analyten in der Routine sind gepufferte Eluenten unerlässig. Die Reproduzierbarkeit ist durch ihren Einsatz generell besser. Dennoch gibt es immer wieder Probleme: Mangelnde Stabilität von Retentionszeiten, Änderung der Peakform, geringe Lebensdauer der Säule. Was sind die Ursachen dafür? Die Lösung Denken Sie bitte an folgende Fehlerquellen: Falscher Puffer zu eingestelltem pH-Wert: Z. B. Phosphatpuffer bei pH=5. Zu schwacher Puffer: Z. B. Trennung von starken Basen und Verwendung eines 5 oder 10 mMol-Puffers – 20 mMol wäre „sichererer“. Messung in einem Bereich von +/- 1 pH-Einheit von pKs- Wert der Komponente. Z. B.Trennung von…

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5. Juni 2001

Ein Peak verhält sich „komisch“ – was kann die Ursache sein?

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Fast alle Peaks bei einer Wiederholmessung verhalten sich recht „anständig“, d.h. Retentionszeit, Fläche, Peakform etc. bleiben konstant. Nur ein einziger Peak (oder vielleicht zwei) bereitet Ihnen Kopfschmerzen: Beispielsweise ist er permanent auf Wanderschaft oder er zeigt nicht die Fläche, die er zeigen sollte. Woran kann es liegen? Die Lösung Nachfolgend nenne ich Ihnen einige Ursachen. Die Betonung liegt wirklich auf „einige“, denn besprochenes Problem ist tatsächlich eines der unangenehmsten im HPLC-Alltag. Ich bin sicher, dass erfahrene LeserInnen auf manch weitere Ursache hinweisen könnten. Veränderung der Retentionszeit „Wanderung“ ( nur eines oder weniger Peaks ) deutet auf einen multiplen…

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9. Mai 2001

Verschiebung des pH-Wertes im Eluenten – Gründe und Ausmaß

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Je mehr ich mich mit der Rolle des pH-Wertes befasse, um so „erschreckender“ wird für mich die Erkenntnis, wie schwerwiegend und diffizil sein Einfluss auf die Trennung von sauren und alkalischen Komponenten in der RP-HPLC ist… Hier wollen wir einen einzigen Aspekt herauspicken und zwar die Gründe für seine ungewollte Verschiebung. Also: Wann müssen wir mit einer pH-Wert-Verschiebung rechnen? Die Lösung Dazu gleich die Ergebnisse einiger Experimente, die ich in letzter Zeit durchgeführt habe: Was sind die Konsequenzen? Eine unkontrollierte pH-Wert-Verschiebung kann die Robustheit der Methode beeinträchtigen, d. h. es können sowohl die Retentionszeit als auch die Selektivität…

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7. Juni 2000

Peakdeformation und Retentionszeitverschiebung aufgrund eines ungeeigneten Probelösungsmittels

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Sie arbeiten mit einer einfachen, robusten Methode. Auch Ihre Säule ist recht neu. Dennoch eluieren alle oder ein Teil Ihrer Peaks mit einem Fronting und/oder die Retentionszeiten sind nicht konstant. Was könnte der Grund sein? Die Lösung Ein Fronting (das Gegenteil von Tailing, manchmal als „Fronttailing“ bezeichnet) ist fast immer als sicherer Hinweis anzusehen, dass Probelösungsmittel und Eluent nicht identisch sind. Oder noch konkreter, das Probelösungsmittel ist stärker als der Eluent. Sie arbeiten beispielsweise mit MeOH/H2O oder ACN/H2O beziehungsweise Puffer als Eluent und die Probe ist in reinem Methanol oder Acetonitril gelöst. Ergebnis: Fronting oder sogar Doppelpeaks, evtl….

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10. Mai 2000

Warum verschiebt sich der pH-Wert trotz richtigem Puffer und ausreichender Pufferkapazität?

Von A Fehlersuche, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten mit einem RP-System und folgendem Eluenten: MeOH (oder Acetonitril)/ Kaliumdihydrogen-Phosphatpuffer, pH = 7,5, 45/55 (v/v) und trennen basische Substanzen. Die Trennung ist gut, viel zu gut. Also erhöhen sie – um Zeit zu gewinnen – den Methanolanteil auf 80 % oder Sie fahren einen 40 → 80 % MeOH-Gradienten bei sonst gleichen Bedingungen … und Sie verstehen die Welt nicht mehr: Die Basen kommen nicht einfach früher wie es sich gehört. Nein, alle oder ein Teil davon macht riesige Retentionszeit-Sprünge nach hinten und/oder die Selektivität ändert sich und/oder die Säule hält nicht mehr so lange und so…

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7. März 2000

Zusätzliche Peaks bei Trennungen in der Spurenanalytik

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Annahme: Sie arbeiten im Spurenbereich und jeder, auch winzigste Peak, ist für Sie von Bedeutung. Lassen Sie uns zwei typische Fälle betrachten: Sie arbeiten mit einer bekannten Probe und finden bei der zweiten Injektion ein, zwei zusätzliche kleine Peaks, die beim Vergleichschromatogramm fehlen. Ab der dritten, vierten Injektion tauchen sie nicht mehr auf. Sie arbeiten mit einer neuen Probe. Die erste Injektion ist in Ordnung, die zweite bis fünfte jedoch droht Ihre gute Freitags-Laune zu verderben, denn auf einmal erscheinen neue Peaks im Chromatogramm. Nachdem Sie nun nachmittags eine Wiederholmessung gewagt haben, sind Sie nach einem Blick auf…

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9. September 1999