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Gradient

Peaks kommen zu spät – was tun?

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine Trennung mit einer guten Auflösung erzielt. Die nächste Frage könnte (sollte!) wie folgt lauten: „Wie kann ich am unproblematischsten die Analysenzeit verkürzen?“ Die Lösung Ganz einfach: Fluss erhöhen. Es ist mir bewusst, dass vielen LeserInnen diese Antwort recht banal erscheint. Im Grunde genommen ist sie es auch. Dennoch macht es Sinn darauf hinzuweisen, denn es existieren für meine Begriffe weltweit einfach viel zu viele Prüfvorschriften mit „Fluss: 1 ml/min“. Eine Flusserhöhung führt stets zu Zeitersparnis oder beim Gradienten sogar zur Verbesserung der Auflösung (siehe weiter unten), die Nachteile, die man sich einhandelt, sind gering –…

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8. Oktober 2000

Warum verschiebt sich der pH-Wert trotz richtigem Puffer und ausreichender Pufferkapazität?

Von A Fehlersuche, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten mit einem RP-System und folgendem Eluenten: MeOH (oder Acetonitril)/ Kaliumdihydrogen-Phosphatpuffer, pH = 7,5, 45/55 (v/v) und trennen basische Substanzen. Die Trennung ist gut, viel zu gut. Also erhöhen sie – um Zeit zu gewinnen – den Methanolanteil auf 80 % oder Sie fahren einen 40 → 80 % MeOH-Gradienten bei sonst gleichen Bedingungen … und Sie verstehen die Welt nicht mehr: Die Basen kommen nicht einfach früher wie es sich gehört. Nein, alle oder ein Teil davon macht riesige Retentionszeit-Sprünge nach hinten und/oder die Selektivität ändert sich und/oder die Säule hält nicht mehr so lange und so…

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7. März 2000

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“: Säulen- und Eluentenauswahl

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

These: Es ist realistisch, eine Methode innerhalb von zwei Arbeitstagen zu ca. 80% zu entwickeln. Betrachten wir folgenden fiktiven Fall (Siehe für eine  kürzer-gefasste Version dieses Konzepts diesen HPLC-Tipp): Der Fall Ihr Chef kommt Dienstag Morgen recht konsterniert ins Labor, überreicht Ihnen eine ganz, ganz wichtige Probe direkt aus der Synthese und fleht Sie an, eine Trennung bis morgen Abend irgendwie hinzukriegen. Er fliegt am Donnerstag früh in die Staaten und bräuchte dringend die Information über die Anzahl der Probenbestandteile, es geht also um qualitative Analyse. Eigentlich ist Ihr Chef ein netter Mensch und das ist nicht seine Art, also…

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8. Januar 2000

Zusätze im Eluenten

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Bei der Herstellung von Eluenten werden immer wieder bestimmte Zusätze (Additiva, „Modifier“) verwendet. Das sind kleine Mengen bestimmter Substanzen – in der Regel im Promille- oder im unteren Prozentbereich -, die einem meist binären Eluenten zugesetzt werden. Wann ist dies notwendig und was bewirken diese Zusätze? Die Lösung Die HPLC-Trickkiste ist unerschöpflich. Die Hauptziele dabei sind: eine bessere Peakform und eine Änderung der Selektivität. Nachfolgend finden Sie in tabellarischer Form für häufige Anwendungen bewährte Zusätze. Häufige Zusätze im Eluenten Das Fazit Kleine Zusätze haben oft eine große Wirkung. In Hinsicht auf Robustheit beachten Sie bitte jedoch folgendes: Nach…

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8. Juli 1997

Wie optimiere ich eine Gradiententrennung?

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Eine Gradiententrennung ist am effektivsten über das Gradientenprofil, die Steigung des Gradienten und das Gradientenvolumen zu optimieren. Eine gewünschte Auflösung in kurzer Zeit ist oft erst nach Verlassen der üblichen linearen Gradienten zu erreichen. Denken Sie daher auch an konvexe, konkave oder zusammengesetzte lineare Gradientenkurven mit isokratischen Stufen dazwischen – allerdings: Steht Methodentransfer ins Haus würde ich bei linearen Gradienten bleiben. Zum Herausfinden eines optimalen Gradienten leisten Optimierungsprogramme wie z. B. DryLab, Fusion QbD und ChromSword wertvolle Hilfestellung. Die zweite Optimierungsmöglichkeit ist die Änderung des Gradientenvolumens. Schauen wir uns diese zweite Möglichkeit an, ist sie doch auch ohne…

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21. Januar 1997

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“ Teil 2: Feinoptimierung

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung

Der Fall Sie haben nun, wie in diesem Tipp geschildert, die „optimale“ Säule ausgesucht, jetzt haben Sie knapp einen Tag Zeit für die Feinoptimierung. Wie geht´s weiter? Die Lösung Nehmen wir an, Sie haben viele Peaks, also werden Sie wahrscheinlich mit dem Gradienten weiter experimentieren. 1. Ziel: „Vernünftige“ Analysendauer + grob „gute“ Trennung Die Möglichkeiten: Gradientenvolumen erhöhen/erniedrigen – am besten über den Fluss, siehe z. B. diesen Tipp Anfangs- und Endbedingungen variieren Evtl. Steilheit, Gradientenprofil ändern beziehungsweise eine isokratische Stufe einbauen. Zeitbedarf: ca. 2 Stunden 2. Ziel: Selektivität verbessern Die Möglichkeiten: pH-Wert um +/- 0,5 pH-Einheiten variieren Modifier wie z.B….

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9. März 1993