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Optimierung

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben…

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8. Oktober 2002

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 1

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Sie sind an´s Ende einer Trennungsoptimierung angelangt, Ihre Peaks sehen recht anständig aus. Sie stehen nun vor der Frage: „Wie kann ich schnell die Peakhomogenität überprüfen?“ „Schnell“ bedeutet ohne großartige Hardware-Änderung (z. B. Säulenschaltventil einbauen) oder Änderung an der „Chemie“ (z. B. anderer Puffer). Im hiesigen Tipp sowie teilweise in diesem Tipp werden wir uns mit solch einfachen Maßnahmen beschäftigen, deren Realisierung höchstens ein Paar Minuten bis eine viertel Stunde dauert. In diesem Tipp werden wir uns etwas aufwendigere Maßnahmen anschauen. Die Lösung 1. Änderung von Einstellungen Durch Änderung von Einstellungen an der Apparatur wird natürlich nicht die…

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9. April 2002

Wann wird eine „polare“ C18-Phase benötigt?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Auf dem Markt gibt es eine Reihe von hydrophoben, gut endcappeden, Metallionen-armen C18- und C8-Phasen eingeführt. Der Vorteil dieser Phasen liegt im Wesentlichen in der guten Chargenreproduzierbarkeit sowie in der hervorragenden Symmetrie für basische Analyten. Darüber hinaus wird eine gute Selektivität für organische Moleküle beobachtet – auch für welche mit polaren Gruppierungen. Sollte nun vor dem Hintergrund dieser handfesten Vorteile eine derartige Phase die erste Wahl bei der Entwicklung einer neuen Methode sein? Die Lösung Nicht unbedingt. Denn für die Trennung bestimmter Analyttypen sind polare Wechselwirkungen notwendig – und zu solchen sind Phasen mit einer ausgesprochen hydrophoben, gut…

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5. Februar 2002

Erniedrigung der Nachweisgrenze durch Optimierung der Injektion

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Optimierung

Der Fall Die Verbesserung der Peakform ist in der Spurenanalytik (Reinheit, Stabilitäts- und Toxizitäts-Untersuchungen, Reinigungsvalidierung, Umweltanalytik) wichtiger als sonstwo. Denn wenn ich bei konstant injizierter Menge – und damit gleicher Fläche – einen scharfen und damit höheren Peak erhalte, ist die Quantifizierung mit einem kleineren Fehler behaftet. Es existieren einige bewährte Maßnahmen, die zu schmalen Peaks führen, z. B. dünnere Säulen, kleinere Teilchen, Erniedrigung des Totvolumens der Apparatur, Optimierung der Detektion, Verbesserung der Kinetik (Temperatur, Modifier) usw. Heute werden wir uns mit ein paar einfachen Tricks beim Injizieren beschäftigen. Die Lösung Es gibt zwei Ansätze: 1.) Verdünnung der Substanzzone verhindern…

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14. November 2000

Peaks kommen zu spät – was tun?

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine Trennung mit einer guten Auflösung erzielt. Die nächste Frage könnte (sollte!) wie folgt lauten: „Wie kann ich am unproblematischsten die Analysenzeit verkürzen?“ Die Lösung Ganz einfach: Fluss erhöhen. Es ist mir bewusst, dass vielen LeserInnen diese Antwort recht banal erscheint. Im Grunde genommen ist sie es auch. Dennoch macht es Sinn darauf hinzuweisen, denn es existieren für meine Begriffe weltweit einfach viel zu viele Prüfvorschriften mit „Fluss: 1 ml/min“. Eine Flusserhöhung führt stets zu Zeitersparnis oder beim Gradienten sogar zur Verbesserung der Auflösung (siehe weiter unten), die Nachteile, die man sich einhandelt, sind gering –…

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8. Oktober 2000

Nicht-endcappede Phasen – „ad acta“ legen?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuartiger C18-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappte sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell-, monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl ist? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als alte Technologie „ad acta“ legen? Die Lösung Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer…

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5. April 2000

Wie trenne ich Säuren mittels RP C18?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten organische Verbindungen mit saurem Charakter trennen. Die Rede ist nicht von Aminosäuren oder organischen/anorganischen Säuren. Für diese Substanzklassen existieren sehr gute Standardapplikationen. Bei Ersteren erfolgt die Trennung durch Vor- beziehungsweise Nachsäulederivatisierung und Gradientelution. Letztere werden an starken/schwachen Ionenaustauschern getrennt. Welche RP-Systeme könnten nun in Frage kommen? Die Lösung Man nehme wie folgt: Die Säule Nicht endcappede, „klassische“ Säulen, weil diese im Sauren, siehe weiter unten, stabiler als endcappede sind oder einige moderne, speziell für den Einsatz im Sauren entwickelte Säulen, es sei hier je ein Vertreter genannt: LiChrospher, Zorbax SB. Der Eluent Es…

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5. Februar 2000

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“: Säulen- und Eluentenauswahl

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

These: Es ist realistisch, eine Methode innerhalb von zwei Arbeitstagen zu ca. 80% zu entwickeln. Betrachten wir folgenden fiktiven Fall (Siehe für eine  kürzer-gefasste Version dieses Konzepts diesen HPLC-Tipp): Der Fall Ihr Chef kommt Dienstag Morgen recht konsterniert ins Labor, überreicht Ihnen eine ganz, ganz wichtige Probe direkt aus der Synthese und fleht Sie an, eine Trennung bis morgen Abend irgendwie hinzukriegen. Er fliegt am Donnerstag früh in die Staaten und bräuchte dringend die Information über die Anzahl der Probenbestandteile, es geht also um qualitative Analyse. Eigentlich ist Ihr Chef ein netter Mensch und das ist nicht seine Art, also…

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8. Januar 2000

Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peakverbreiterung, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an…

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14. Dezember 1999

Unbekanntes Trennproblem – wie soll ich anfangen?

Von ACN, B Optimierung, HPLC-Tipps, Nicht berücksichtigen, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Wasser

Der Fall Gehen wir von dem Fall aus, dass Sie eine Trennung „hinkriegen“ sollen. Dass die Zeit drängt, brauchen wir nicht zu erwähnen und dass Sie wenig über die Probe wissen, ist ebenfalls logisch….. Dass weiterhin die einzige HPLC-erfahrene Kollegin in Urlaub ist, versteht sich von selbst und der Laborleiter, der zufällig ein HPLC-Experte ist, weilt auf einer HPLC-Tagung und anschließend in Kur. Sie also, mutterseelenallein im Labor, ein Fläschchen mit einem unbekannten Etwas in der Hand und auf dem Schreibtisch ein Zettel mit einem riesigen EILT!. Wie sollte man so etwas anpacken – vorausgesetzt, Sie gehen nicht gleich nach…

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8. März 1998