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Wo kommt ein Geisterpeak her?

By A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Der Fall Geister trifft man selten im Labor an – obwohl ich dem Verdacht nicht loswerde, dass sie dort doch des öfteren ihr Unwesen treiben… Geisterpeaks dagegen sind, leider Gottes, ganz quicklebendige Erscheinungen. Was sind Geisterpeaks? Das sind Peaks, die ganz unerwartet in dem Chromatogramm erscheinen. Wo kommen sie nun her und wie kann man deren Herkunft einreihen? (siehe auch diesen HPLC-Tipp). Die Lösung Die häufigsten Ursachen für Geisterpeaks sind: Verunreinigungen aus dem Eluenten, überschüssiges Ionenpaarreagenz usw. spät eluierende Substanzen Memoryeffekt durch Desorption einer Substanz aus der stationären Phase, aus einer Dichtung, einem Fitting, einer Fritte etc. Luftblasen im Detektor Zersetzungsprodukte…

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9. März 1997

Spikes im Chromatogramm

By A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ihre Chromatogramme sehen recht anständig aus, doch ärgern Sie sich immer wieder über auftretende Spikes. Dies sind kleinere oder größere Striche, die häufig an verschiedenen Stellen im Chromatogramm erscheinen. Welche Ursachen können dafür verantwortlich sein und was kann man dagegen tun? Die Lösung Die Hauptursachen für Spikes sind: Luftblasen, Detektor, Elektronik, „Sonstiges“. Schauen wir uns die einzelnen Ursachen etwas genauer an. Luftblasen Einfacher Beweis für Luftblasen in der Pumpe (Δ tR): Wenn Sie die Pumpe ausschalten, sind auch die Spikes weg. Luftblasen im Detektor (Luftbläschen aus dem Eluenten direkt nach der Säule, „Ausgasen“) ergeben eine „unmögliche“ Basislinie, die…

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9. Februar 1997

Wie optimiere ich eine Gradiententrennung?

By B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Eine Gradiententrennung ist am effektivsten über das Gradientenprofil, die Steigung des Gradienten und das Gradientenvolumen zu optimieren. Eine gewünschte Auflösung in kurzer Zeit ist oft erst nach Verlassen der üblichen linearen Gradienten zu erreichen. Denken Sie daher auch an konvexe, konkave oder zusammengesetzte lineare Gradientenkurven mit isokratischen Stufen dazwischen – allerdings: Steht Methodentransfer ins Haus würde ich bei linearen Gradienten bleiben. Zum Herausfinden eines optimalen Gradienten leisten Optimierungsprogramme wie z. B. DryLab, Fusion QbD und ChromSword wertvolle Hilfestellung. Die zweite Optimierungsmöglichkeit ist die Änderung des Gradientenvolumens. Schauen wir uns diese zweite Möglichkeit an, ist sie doch auch ohne…

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21. Januar 1997

Ist der linke oder der rechte Pumpenkopf defekt?

By A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe

Der Fall Die Ein- und Auslassventile sind die Schwachpunkte Nr. l jeder HPLC-Pumpe. Wenn Sie nun Flussschwankungen festgestellt und Luft als Ursache ausgeschlossen haben, bleibt Ihnen nichts anderes übrig, als in den sauren Apfel zu beißen und den Pumpen­kopf auseinanderzubauen (lassen). Viele der HPLC-Pumpen sind heute Doppelkolbenpumpen. Die Frage ist also, welcher Kopf muss ausgebaut werden, der linke oder der rechte? Zudem ist nun das Einlass- oder das Auslassventil verschmutzt? Eine 25%ige Chance, das richtige Teil auszubauen, ist zwar nicht schlecht, doch könnten Sie auch folgen­den Trick anwenden, um die Trefferquote zu erhöhen. Die Lösung Man saugt eine Luftblase von…

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29. Dezember 1996

Trennung von ionischen Substanzen – wann ist was besser: Endcappede Phasen, inerte Phasen, Phosphatpuffer oder Ionenpaarreagenz? Teil II

By B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns bereits mit einem der schwierigsten Problemen in der RP-HPLC beschäftigt, nämlich mit der Trennung von polaren und ionischen Komponenten. Im hiesigen HPLC-Tipp wird dieses Thema weiter vertieft. Spätestens, wenn Sie tailende Peaks erhalten und Sie alle anderen Ursachen ausschließen können, wissen Sie, dass Sie es mit ionischen Substanzen zu tun haben, wobei Basen in der Regel unangenehmer sind als Säuren. Nachfolgend sind einige für die Trennung ionischer Substanzen geeignete chromatographische Bedingungen in Tabellenform aufgelistet. ,,Säule“ und ,,Eluent“ müssen dabei nicht immer streng kombiniert werden, sie können auch einzeln zum Erfolg führen. Die…

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20. Dezember 1996

Was sind die Gründe für Druckänderungen bzw. Druckschwan­kungen ?

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Die Druckänderung in dem Chromatographiesystem ist neben der Verschiebung der Retentionszeit eine der häufigsten Alltagsprobleme. Die Ursachen können vielfältig sein, sowohl mechanischer als auch chemischer Natur. Welche sind die häufigsten Ur­sachen? Die Lösung Ausführliche Auflistungen von möglichen Ursachen und deren Behebung finden sich in der Literatur z. B. in Dolan, Snyder „Troubleshooting LC-Systems“ und Unger, Weber „Handbuch der HPLC“. Tab. 1 ist eigens als schnelle Alltagshilfe erstellt. Zu Gunsten der Übersichtlichkeit sind nur die häufigsten Fehler aufgelistet; Ursachen, die selten vorkommen oder eher theoretischer Natur sind, blieben unberücksichtigt. Die Auswahl erfolgte nach persön­lichem Ermessen. Tab.1: Druckänderung in der…

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29. November 1996

Die Lampe ist neu – was ist mit dem Peak los?

By A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps

Der Fall Sie stellen fest, dass im Vergleich zu früheren Chromatogrammen die Peaks kleiner geworden sind oder einfach kleiner erscheinen. Dafür gibt es viele Gründe. Nachfol­gend werden die wichtigen aufgelistet. Fehlerhafte Injektion Eine irreversible Adsorption an der stationären Phase Ein anderer Eluent Instabile Probe „Falsche“ Integrationsparameter Höherer Fluss Niedrigere Temperatur Können diese Fehler ausgeschlossen werden, kann nur noch der Detektor die Ursache sein – aber was genau am Detektor? Die Lösung Folgende Ursachen sind denkbar: Einstellparameter Haben Sie vielleicht einen Einstellparameter am Detektor geändert? Oder sind aus Versehen die Werte von einer Methode gespeichert worden, z. B. Wellenlänge/Referenzwellenlänge, Empfindlichkeit, Zeitkonstante?…

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27. Oktober 1996

Schmutz in der UV-Zelle eines Detektors

By A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Abhängig von der Konstitution der Probe und/oder Matrix kann Schmutz die Oberflä­che einer UV-Zelle belegen. Die Konsequenzen sind: Ein Teil der Lichtenergie geht „verloren“, und man erhält eine verrauschte Basislinie Durch die Schmutzschicht wird quasi die vorher glatte Oberfläche vergrößert. Dadurch wird die UV-Zelle zu einem Luftsammler, d.h. eventuell im Eluenten vorhan­dene kleine Luftbläschen werden dort festgehalten und wachsen zu einer größeren Luftblase, die sich durch „Spikes“, Rauschen und Basisliniendrift bzw. -versatz be­merkbar macht. Kurzum, Schmutz in der UV-Zelle bewirkt folgendes: Schlechtes Peak/Rauschen-Ver­hältnis, Spikes und Basislinienprobleme. Die Zelle muss gereinigt werden. Wie erfolgt nun dies am effektivsten? Die…

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27. September 1996

Spülen einer HPLC-Anlage

By ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Spülen ist sicherlich eine der besten präventiven und kurativen Maßnahmen in der HPLC. Während für die meisten Anwender der Spülschritt bei einer Gradientenelution am Ende des Laufs einfach dazugehört, erfolgt bei isokratischen Trennungen ein solcher in der Regel erst bei Bedarf, was aus ökonomischen Gesichtspunkten auch richtig ist. Schauen wir uns doch an, an welchen Symptomen dieser „Bedarf“ erkannt wird, was die Ursachen sind und wie gespült werden sollte. Bemerkung: Einige der unten aufgeführten Symptome (z. B. Tailing, Änderung der Retentionszeit) können natürlich auch andere Ursachen haben. Die Lösung Tab. 1: Spülen einer HPLC-Anlage Das Fazit Mit sauberem…

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27. August 1996

Probenvorbereitung — wie kritisch sind welche Fehler?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Probenlösungsmittel

Es gibt glückliche Anwender, die ihre Probe im Eluenten auflösen und direkt injizie­ren können. Wenn Sie zu diesen gehören und Sie noch einen isokratischen ACN/H2O-Lauf haben, können Sie recht getrost das Wort „Probenvorbereitung“ vorerst verges­sen. Es gibt wiederum Anwender, die aus Galle die Nebenkomponente eines metabolisierten Metaboliten quantifizieren müssen, und andere, die Heterocyclen mit Schwe­felatomen im Erdölrückstand des irakischen im Vergleich zum libyschen Erdöl auf­spüren müssen. Ihnen gehört unsere ganze Sympathie. Nachfolgend einige typische Fehlerquellen im Rahmen einer normalen Probenvorbereitung in tabellarischer Form. Tab. 1: Typische Fehlerquellen bei der Probenvorbereitung Lösen von Proben Herstellung von Eluenten Einige weitere beachtenswerte Punkte:…

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27. Juli 1996