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Die Lampe ist neu – was ist mit dem Peak los?

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps

Der Fall Sie stellen fest, dass im Vergleich zu früheren Chromatogrammen die Peaks kleiner geworden sind oder einfach kleiner erscheinen. Dafür gibt es viele Gründe. Nachfol­gend werden die wichtigen aufgelistet. Fehlerhafte Injektion Eine irreversible Adsorption an der stationären Phase Ein anderer Eluent Instabile Probe „Falsche“ Integrationsparameter Höherer Fluss Niedrigere Temperatur Können diese Fehler ausgeschlossen werden, kann nur noch der Detektor die Ursache sein – aber was genau am Detektor? Die Lösung Folgende Ursachen sind denkbar: Einstellparameter Haben Sie vielleicht einen Einstellparameter am Detektor geändert? Oder sind aus Versehen die Werte von einer Methode gespeichert worden, z. B. Wellenlänge/Referenzwellenlänge, Empfindlichkeit, Zeitkonstante?…

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27. Oktober 1996

Schmutz in der UV-Zelle eines Detektors

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Abhängig von der Konstitution der Probe und/oder Matrix kann Schmutz die Oberflä­che einer UV-Zelle belegen. Die Konsequenzen sind: Ein Teil der Lichtenergie geht „verloren“, und man erhält eine verrauschte Basislinie Durch die Schmutzschicht wird quasi die vorher glatte Oberfläche vergrößert. Dadurch wird die UV-Zelle zu einem Luftsammler, d.h. eventuell im Eluenten vorhan­dene kleine Luftbläschen werden dort festgehalten und wachsen zu einer größeren Luftblase, die sich durch „Spikes“, Rauschen und Basisliniendrift bzw. -versatz be­merkbar macht. Kurzum, Schmutz in der UV-Zelle bewirkt folgendes: Schlechtes Peak/Rauschen-Ver­hältnis, Spikes und Basislinienprobleme. Die Zelle muss gereinigt werden. Wie erfolgt nun dies am effektivsten? Die…

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27. September 1996

Spülen einer HPLC-Anlage

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Spülen ist sicherlich eine der besten präventiven und kurativen Maßnahmen in der HPLC. Während für die meisten Anwender der Spülschritt bei einer Gradientenelution am Ende des Laufs einfach dazugehört, erfolgt bei isokratischen Trennungen ein solcher in der Regel erst bei Bedarf, was aus ökonomischen Gesichtspunkten auch richtig ist. Schauen wir uns doch an, an welchen Symptomen dieser „Bedarf“ erkannt wird, was die Ursachen sind und wie gespült werden sollte. Bemerkung: Einige der unten aufgeführten Symptome (z. B. Tailing, Änderung der Retentionszeit) können natürlich auch andere Ursachen haben. Die Lösung Tab. 1: Spülen einer HPLC-Anlage Das Fazit Mit sauberem…

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27. August 1996

Probenvorbereitung — wie kritisch sind welche Fehler?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Probenlösungsmittel

Es gibt glückliche Anwender, die ihre Probe im Eluenten auflösen und direkt injizie­ren können. Wenn Sie zu diesen gehören und Sie noch einen isokratischen ACN/H2O-Lauf haben, können Sie recht getrost das Wort „Probenvorbereitung“ vorerst verges­sen. Es gibt wiederum Anwender, die aus Galle die Nebenkomponente eines metabolisierten Metaboliten quantifizieren müssen, und andere, die Heterocyclen mit Schwe­felatomen im Erdölrückstand des irakischen im Vergleich zum libyschen Erdöl auf­spüren müssen. Ihnen gehört unsere ganze Sympathie. Nachfolgend einige typische Fehlerquellen im Rahmen einer normalen Probenvorbereitung in tabellarischer Form. Tab. 1: Typische Fehlerquellen bei der Probenvorbereitung Lösen von Proben Herstellung von Eluenten Einige weitere beachtenswerte Punkte:…

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27. Juli 1996

Ist die vorliegende Methode eine robuste Methode?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Robustheit

Der Fall Die Kollegen aus der Entwicklung schicken Ihnen eine Methode oder der Chef kommt triumphierend in das Labor mit der Kopie einer Methode in der Hand und sagt: „Machen Sie mal.“ Oder Sie bekommen den neuesten Prospekt der Firma Fanta­siechrom GmbH mit der Abbildung eines Chromatogramms samt Methode, die Sie gut gebrauchen können. Bevor Sie irgend etwas Chromatographisches anfangen, wür­de ich Ihnen dringend empfehlen, die Methode bei einer Tasse Kaffee/Tee etwas genauer anse­hen. Die Lösung Bei einigen Methoden weiß man/frau von Anfang an, dass sie kaum robust sein können. Wenn Sie dennoch die Methode übernehmen müssen, sollten Sie wenigstens…

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26. Juni 1996

Wie wähle ich meine HPLC-Anlage bzw. meinen HPLC-Lieferanten aus?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Vielleicht haben Sie demnächst beim Kauf einer Anlage zu entscheiden, welches Ge­rät gekauft wird, oder Sie sollen für den Chef die Entscheidung vorbereiten. Auch für erfahrene Anwender kann dies bei der aktuellen Anzahl von Herstellern und Gerätetypen zu einem großen Problem werden. Welche Fragen sollten Sie im Vorfeld für sich abklären? Die Lösung Wir gehen in dem konkreten Fall davon aus, dass die Entscheidung für die HPLC als die geeignete Methode für Ihr Trennproblem richtig ist – nicht immer eine triviale Entscheidung. Man sollte bei dem Kauf sowohl Kriterien allgemeiner Natur als auch wissenschaftlich-technische Forderungen berücksichtigen. Zu den…

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26. Mai 1996

Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperaturveränderungen? Teil II: Säule, Trennung

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Durch eine Änderung der Trenntemperatur ändern sich die chromatographischen Grö­ßen sowohl in physikalischer (Δ Viskosität => Δ Kinetik => Δ Effizienz) als auch in chemischer/thermodynamischer Hinsicht: Δ Sorptionsenthalpie => Δ Retentionszeit => Δ Selektivität. Somit ist die Temperatur ein chromatographischer Parameter, mit dem die Trennung gezielt verändert werden kann. Wie ist nun der Parameter „Tem­peratur“ konkret zur Trennungsoptimierung einzusetzen? Die Lösung Eine Temperaturerhöhung bewirkt folgendes: Chemie Die Retentionszeit nimmt stets ab (einige chirale Trennungen stellen seltene Ausnahmen dar). Diese Abnahme verläuft für unterschiedliche Substanzen ungleich­mäßig. Somit haben wir eine Änderung der Selektivität. Diese ist z. B. stark ausge­prägt…

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26. April 1996

Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperatureränderungen? Teil I: Allgemeines, Detektor

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Teil I: Allgemeines, Detektor Der Fall Die Temperatur hat eine direkte Einwirkung auf das chromatographische Ergebnis, da sie … die Wechselwirkung Probe ↔ stationäre Phase, die Viskosität des Eluenten und das Auflösen des Kieselgels … beeinflusst. Ferner kann sich bei erhöhter Temperatur manche Substanz zersetzen. Schließlich machen sich Temperaturschwankungen in der Detektorzelle im Chromatogramm von sehr stark (elektrochemischer Detektor) bis „nur“ ärgerlich (UV-Detektor) bemerkbar. Schauen wir uns hier das Problem eher allgemein von seiner technischen Seite her an. In diesem HPLC-Tipp wird uns der Komplex „Temperatur-Trennung“ beschäftigen. Die Lösung Ohne „Wenn und Aber“ gilt folgendes: Eine konstante Temperatur erhöht die Robust­heit…

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22. März 1996

Maximal zulässiges Injektionsvolumen ?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung

Der Fall Durch die Art der Probenvorbereitung erhalten Sie eine stark verdünnte Probelösung oder Sie haben mit der Nachweisgrenze zu kämpfen, jedenfalls würden Sie gerne aus bestimmten Gründen ein relativ großes Probevolumen direkt injizieren. Wie groß darf dieses Volumen sein, ohne dass Sie sich dadurch eine merkliche Peakverbreiterung einhandeln? Wir setzen voraus, dass die Säule nicht überladen ist; hier ist also die Rede von einer evtl. Peakverbreiterung nur aufgrund der Injektion. Die Lösung Man kann über die Varianten der einzelnen Beiträge zur Peakverbreiterung das zuläs­sige Injektionsvolumen ausrechnen. Das ist möglich, da wir in der HPLC stochastisch unabhängige Prozesse haben. Nur…

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22. Februar 1996

Injektion von Substanzen aus wäßrigen Lösungen

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Angenommen, Sie arbeiten mit Wasser als Probelösungsmittel. Wenn Sie bei konstant injizierter Probemenge unterschiedliche Peakflächen erhalten sollten, könnte dies an der teilweise irreversiblen Sorption Ihrer Substanz an einer „rauhen“ Oberfläche im HPLC-System liegen. Die Lösung Die irreversible Sorption vor allem von höhermolekularen Substanzen (z. B. Polyzuckern, Proteinen) an Stahl- oder Glasoberflächen oder am Dichtungsmaterial ist ein bekanntes Problem. Wenn die Probe in reinem Wasser aufgelöst ist, können derartige Oberflächen sich wie schwache stationäre Phasen (apolare Pseudophasen) verhalten, an denen eine geringe Menge der Probe sorbiert wird (Physisorption, Adhäsion). Sie kann ihrerseits nun bis zur Erschöpfung ihrer Kapazität weiteres…

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22. Januar 1996